إنتاج وتنقية جزيئات فيروس التهاب الكبد B المؤتلف

الملخص

المصدر: Nishitsuji, H., et al. تطوير نظام مراسل لفيروس التهاب الكبد B لمراقبة المراحل المبكرة من دورة التضاعف. J. Vis. Exp. (2017)

يوضح هذا الفيديو كيفية إنتاج وتنقية جزيئات فيروس التهاب الكبد B المؤتلف، مما يتيح تحضير مستحضرات فيروسية آمنة وناقصة التضاعف لدراسة أحداث العدوى المبكرة ولتطبيقات الفحص عالي الإنتاجية للأدوية المضادة للفيروسات.

البروتوكول

1. إنتاج فيروس التهاب الكبد B (HBV) المؤتلف الذي يشفر البروتين المراسل

1. تحضير خلايا HepG2
   1. تحضير وسط زراعة الخلايا (وسط Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) المكمل بـ 10% مصل جنين البقر (FBS)، و100 U/ml بنسلين، و100 µg/ml ستريبتومايسين، و100 U/ml أحماض أمينية غير أساسية).
   2. زرع 4 x 10⁶ من خلايا HepG2 (سرطان الخلايا الكبدية البشرية G2) في طبق قطر 10 سم مغطى بالكولاجين في 10 ml من وسط الزراعة قبل يوم من عملية عفن الخلايا (transfection). تُحضن خلايا HepG2 عند 37 °C في حاضنة رطبة تحتوي على 5% CO₂.
      ملاحظة: عند زرع ما يقرب من 4 x 10⁶ من خلايا HepG2 في طبق قطر 10 سم مغطى بالكولاجين في 10 ml من وسط الزراعة، ستصل نسبة تلاقي الخلايا (confluency) إلى 70-90% في اليوم التالي.
2. عفن الخلايا (Transfection)
   1. إجراء عملية عفن لخلايا HepG2 باستخدام 5 µg من pUC1.2HBV delta epsilon15 (بلازميد تضاعف HBV يحتوي على حذف في تسلسل epsilon) و 5 µg من pUC1.2HBV/NL15 باستخدام كاشف عفن وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة.
   2. في اليوم التالي، يُزال وسط الزراعة ويُضاف 10 ml من وسط زراعة جديد.
   3. بعد مرور أسبوع على عملية العفن، يُنقل وسط الزراعة الذي يحتوي على HBV المؤتلف إلى أنبوب سعة 50 ml، ثم يتم الانتقال إلى الخطوة 1.3. يُضاف 10 ml من وسط زراعة جديد إلى الطبق الذي يحتوي على الخلايا المعفنة.
      ملاحظة: يتم الحفاظ على إنتاج HBV المؤتلف لمدة 4 أسابيع. ويمكن تخزين وسط الزراعة الذي يحتوي على HBV المؤتلف عند 4 °C لمدة شهر واحد.
3. تنقية HBV المؤتلف
   1. إزالة حطام الخلايا من وسط الزراعة الذي يحتوي على HBV المؤتلف عن طريق الطرد المركزي (2,300 x g لمدة 5 min).
   2. تمرير الطافي عبر مرشح غشائي بمسامية 0.45 µm.
   3. إضافة حجم مساوٍ من 26% PEG/1.5 M NaCl (بولي إيثيلين جلايكول 6000: 130 g، وكلوريد الصوديوم NaCl: 49 g، و 1 ml من 0.5 M EDTA (حمض إيثيلين ثنائي الأمين رباعي الخليك) عند pH 8.0، و 5 ml من 1 M HEPES (حمض N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic) عند pH 7.6 في 500 ml) إلى وسط الزراعة الذي يحتوي على HBV المؤتلف والمزج برفق. تُحضن العينة طوال الليل عند 4 °C.
   4. الطرد المركزي عند 2,300 x g لمدة 20 min عند 4 °C.
   5. التخلص من الطافي وإذابة الراسب في 0.5 ml من TNE (10 mM Tris، و 50 mM NaCl، و 1 mM EDTA).
   6. إزالة الحطام عن طريق الطرد المركزي عند 2,300 x g لمدة 5 min.
   7. تحميل 0.5 ml من TNE الذي يحتوي على HBV المؤتلف فوق 0.8 ml من السكروز بتركيز 20% في TNE.
   8. الطرد المركزي عند 100,000 × g لمدة 3 hr عند 15 °C.
   9. التخلص من أكبر قدر ممكن من الطافي، والاحتفاظ بالراسب. يُعاد تعليقه في 1 ml من DMEM خالي من المصل لكل 40 ml من وسط الزراعة الأصلي.
   10. التحضين طوال الليل عند 4 °C.
   11. الترشيح عبر مرشح بمسامية 0.45 µm. تحضير حصص (aliquots) بحجم 0.5 ml وتخزينها عند -80 °C.
       ملاحظة: في حال لوحظ تلوث عينة الفيروس الأصلية ببروتين مراسل (reporter protein)، يتم تنقية الفيروس عن طريق الطرد المركزي الفائق بتدرج الكثافة للسكروز بتركيز 5-30% في TNE عند 100,000 x g لمدة 2 hr، أو الطرد المركزي متوازن الكثافة باستخدام CsCl (كلوريد السيزيوم) من 1.1-1.6 g/ml عند 150,000 x g لمدة 50 hr.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
كاشف مقايسة لوسيفيريز Nano-Glo	Promega	N1110
محلول مختلط من البنسلين والستربتومايسين	Nacalai tesque	09367-34
DMEM	Thermo Fisher Scientific	11995065
طبق مطلي بالكولاجين 100 mm	Iwaki	4020-010
كاشف ترانسفكشن Lipofectamine 3000	Thermo Fisher Scientific	L3000001
بولي إيثيلين جليكول (PEG) 6000	Sigma-Aldrich	81255
بولي إيثيلين جليكول (PEG) 8000	Sigma-Aldrich	89510
NaCl	Nacalai tesque	31319-45
محلول EDTA بتركيز 0.5 mol/L	Nacalai tesque	06894-14
Tris-HCl	Nacalai tesque	35434-21
مرشح Millex-HP، 0.45 μm، من بولي إيثر سلفون	Merck Millipore	SLHP033RS
ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650
طبق 96-عينه مطلي بالكولاجين	Corning	NO3585
HepG2-NTCP1-myc-clone22	-	-
pUC1.2HBV delta epsilon	-	-
pUC1.2HBV/NL	-	-