إسكات الجينات بوساطة فيروس دينسوفيروس المؤتلف في يرقات البعوض

الملخص

المصدر: Liu, P., et al. استخدام فيروس دنزو للبعوض المؤشب كناقل لتوصيل الجينات للتحليل الوظيفي للجينات في يرقات البعوض. J. Vis. Exp. (2017)

يوضح هذا الفيديو استخدام فيروسات الدنسو المعاد تركيبها للبعوض والتي تشفر microRNA لإسكات جينات محددة في يرقات البعوض. وتنتج اليرقات المصابة في الأعمار المبكرة microRNAs وظيفية تعمل على تثبيط تعبير الجينات المستهدفة لإجراء الدراسات اللاحقة.

البروتوكول

1. ترنسدكشن البعوض

1. اغسل 10 يرقة في الطور الأول Aedes albopictus يرقات ثلاث مرات باستخدام الماء منزوع الأيونات، ثم يتم نقل اليرقات إلى دورق يحتوي على 95 مل من الماء منزوع الأيونات. يُضاف 5 مل من الفيروس المأشوب Aedes aegypti مخزونات فيروس densoviru (rAaeDV) (بتركيز نهائي قدره 1.0 × 10¹⁰ نسخة/مل).
2. تحضن لمدة 24 ساعة عند 28 °Cاغسل اليرقات ثلاث مرات باستخدام الماء منزوع الأيونات، ثم انقل اليرقات مرة أخرى إلى الأطباق وقم بتغذيتها بانتظام.
3. راقب مستوى تعبير الجين المستهدف في اليرقات باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR) أو لطخة ويسترن (Western blot).
   ملاحظة: يمكن استخدام طريقة الكشف عن الإشارة الفلورية لعزل اليرقات المصابة بدقة أكبر. على سبيل المثال، للكشف عن الإشارات الفلورية في اليرقات المصابة بفيروس مُعاد التركيب يُعبّر عن بروتين DsRed، يمكن وضع اليرقات على شريحة مقعرة وفحصها باستخدام مجهر فلوري مقلوب كل 8 ساعات حتى مرور يومين على الإصابة. وبمجرد رصد اليرقات الفلورية، يجب فصلها في أكواب اختبار بلاستيكية فردية للسماح بالمراقبة المستمرة لاحقاً. ويمكن من خلال هذه الطريقة تحديد اليرقات التي أصابت العدوى فيها أنسجة متعددة.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
جهاز طرد مركزي	Thermo Scientific	75004260
نظام طرد مركزي	Beckman Coulter	363118
SuperReal PreMix Plus (SYBR Green)	شركة بكين تيانجين للتكنولوجيا الحيوية (Beijing Tiangen Biotech)	FP205