تصوير القفيصات الفيروسية المعالجة حرارياً باستخدام المجهر الإلكتروني النافذ

الملخص

المصدر: Moore, M. D., et al. طرق بديلة في المختبر لتحديد السلامة الهيكلية للقفيصة الفيروسية. J. Vis. Exp.(2017).

يوضح هذا الفيديو كيفية معالجة القفيصات الفيروسية المنقاة حرارياً، وتحضيرها، وتصويرها باستخدام المجهر الإلكتروني النافذ (TEM) للكشف عن التغيرات الهيكلية والتلف الناجم عن الحرارة.

البروتوكول

1. تحضير عينات المجهر الإلكتروني النافذ (TEM)
   1. الحصول على شبكات غشاء دعم كربوني (نيكل) مصممة للمجهر الإلكتروني النافذ (TEM).
      ملاحظة: استشر المنشأة المركزية بشأن الكواشف الموصى بها وكيفية التعامل معها لاستخدامها مع مجهر المنشأة. تأكد من تخزين الشبكات في صندوق يحتوي على مادة مجففة أو في غرفة مفرغة من الهواء لتقليل التعرض للرطوبة.
   2. تمزيق قطع من ورق الترشيح بحجم 5 cm x 5 cm تقريباً. الحصول على أطباق بتري زجاجية وملاقط عكسية ذاتية الإغلاق مناسبة للاستخدام في الفحص المجهري.
   3. قص قطعة من غشاء البارافين بحجم 2.5 cm x 5 cm تقريباً، ووضعها على سطح العمل.
   4. المعالجة الحرارية لـ capsids فيروس نوروفيروس GII.4 Sydney
      1. الحصول على بروتين القفيصة الرئيسي (VP1) المنقى لنوروفيروس البشري من سلالة GII.4 Sydney (رقم الوصول: JX459908) المجمع في capsids. 
         ملاحظة: تم الحصول على الـ capsids المستخدمة في الدراسة بتفضل من R. Atmar (كلية باي لور للطب، هيوستن، تكساس).
      2. تخفيف الـ capsids في محلول 10 mM من حمض 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic (HEPES) بـ (pH 7.4) إلى حجم أقصى قدره 15 µL في أنابيب تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) الفردية ذات الأغطية. تأكد من أن الأنبوب يحتوي على 600 ng على الأقل من ה-capsid. تأكد من وجود 600 ng من الـ capsid لكل تركيبة من المعالجة والـ ligand.
      3. تسخين الجهاز الدوري الحراري مسبقاً إلى درجة حرارة المعالجة الحرارية المطلوبة. 
         ملاحظة: في هذا البروتوكول، تم اختيار المعالجة عند 68 °C لأوقات مختلفة (0 - 25 min).
      4. تسخين جهاز دوري حراري إضافي مسبقاً عند 4 °C للتبريد الفوري. إضافة الأنابيب التي تحتوي على محلول الـ capsid إلى الجهاز الدوري الحراري للمدة المطلوبة. انقل الأنابيب فوراً إلى جهاز دوري مبرد مسبقاً عند 4 °C لمدة 5 min بعد التسخين.
      5. طرد مركزي قصير في جهاز الطرد المركزي لترسيب جميع القطرات في قاع الأنبوب.
      6. سحب قطرة كاملة بحجم ~15 µL من محلول الـ capsid المعالج بواسطة الماصة ووضعها على غشاء البارافين.
   5. أمسك حافة الشبكة بالملاقط، مع السماح لها بالإغلاق على الحافة لتثبيت الشبكة، ثم ضع الشبكة بحيث يكون جانب الكربون للأسفل فوق قطرة المحلول المعالج. اتركها لتحضن لمدة 10 min للسماح للـ capsid بالارتباط بالشبكة.
      1. بناءً على نقاء تحضير الـ capsid، أضف غسلات من محلول 10 mM HEPES إذا لزم الأمر على شكل قطرات بحجم 10-15 µL توضع في خط بعد قطرة الـ capsid المعالجة.
      2. بعد 10 min، ارفع الشبكة مع القطرة. ضع الشبكة بشكل عمودي تقريباً على قطعة من ورق الترشيح لامتصاص القطرة. ارفع قطرة من محلول HEPES المنظم بحجم 10 - 15 µL بالشبكة، واثبت لمدة 30 s، ثم امتصها بقطعة أخرى من ورق الترشيح للغسل.
   6. ضع قطرة بحجم 15 µL من محلول خلات اليورانيل بتركيز 2% على غشاء البارافين في منطقة فارغة.
      1. ارفع قطرة خلات اليورانيل بالشبكة واثبت لمدة 45 s. امتص خلات اليورانيل، مع التأكد من إزالة معظم المحلول. ضع الشبكة بحيث يكون جانب الكربون للأعلى على قطعة من ورق الترشيح، مع الحرص على ألا "تلتصق" الشبكة بالرطوبة الموجودة على الملاقط. ضع ورق الترشيح الذي يحمل الشبكة في طبق بتري زجاجي مفتوح.
         ملاحظة: لا تستخدم أطباق بتري بلاستيكية، لأن الشبكات ستنجذب إليها كهروسكونياً وتلتصق بالطبق.
   7. كرر العملية لجميع المعالجات. ضع أنصاف أطباق بتري التي تحتوي على الشبكات في مجفف طوال الليل لتجف قبل فحصها بواسطة المجهر الإلكتروني النافذ (TEM).
   8. راجع منشأة الفحص المجهري في المؤسسة المعنية بخصوص فحص الشبكات المحضرة. تسمح بعض المنشآت بتدريب المستخدم على تشغيل أجهزة المنشأة. التفاصيل المحددة المتعلقة بإعداد وفحص مجهر معين تخرج عن نطاق هذا المقال.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
تحضير عينات المجهر الإلكتروني النافذ
شبكات المجهر الإلكتروني المصنوعة من النيكل مع غشاء دعم كربوني	لاد للأبحاث	10880-100
ملاقط عكسية ذاتية الإغلاق للمجهر الإلكتروني	تيد بيلا	5372-NM
ورق ترشيح نوعي	سيجما-ألدريتش (واتمان)	WHA1002055
أطباق بتري زجاجية	Sigma-Aldrich	BR455743
محلول HEPES المركز بتركيز 100 ميلي مولار (الرقم الهيدروجيني 7.2)	لا يوجد نص لترجمته.	لا يوجد نص للمصدر.
أسيتات اليورانيل 2%	لا يوجد نص متاح للترجمة.	لا يوجد نص للمصدر.