نقل الجينات بوساطة العاثيات في البكتيريا الحلزونية

الملخص

المصدر: إيغرز، سي. إتش. التلاعب الجيني بوساطة العاثيات للملولبة Borrelia burgdorferi المسببة لداء لايم. J. Vis. Exp. (2022).

يوضح هذا الفيديو عملية نقل الجينات لـسبيروكيتات Borrelia المعدلة وراثياً باستخدام عاثيات بكتيرية غير معدية، مرسبة بواسطة البولي إيثيلين جلايكول، وتحمل بلازميد مقاوم للكاناميسين. بعد التحضين مع البكتيريا، يتم زرع المزرعة على وسط مضاف إليه مضادات حيوية، حيث تنجو فقط الخلايا التي استقبلت البلازميد وتكون مستعمرات. يتم بعد ذلك اختيار هذه المستعمرات وتكثيرها في وسط سائل يحتوي على مضادات حيوية لإنشاء مجتمع بكتيري مستقر حامل للبلازميد لاستخدامه في التطبيقات اللاحقة

البروتوكول

1. مقايسة التحول الجيني بعد ترسيب العاثية φBB-1 باستخدام البولي إيثيلين جليكول (PEG)

1. قم بتحضير مستنبتات B. burgdorferi لاستخدامها كمستقبل في مقايسات التناقل. بناءً على الكثافة المحددة، احسب حجم مستنبت المستقبل المطلوب للحصول على 15 mL من 1 × 107 spirochetes·mL−1.
2. قم بطرد حجم المستنبت مركزياً عند 6,000 x g لمدة 10 min. صب الراشح وأعد تعليق الراسب في 14.5 mL من وسط BSK (Barbour-Stoenner-Kelly) الطازج.
3. أضف ≤500 µL من عينة العاثيات المرسبة بـ PEG إلى مستنبت المستنسخ المستقبل. اخلط جيداً وحضن عند 33 °C لمدة 72-96 h.
   ملاحظة: يمكن أن تكون كمية العاثيات المستعادة أثناء الترسيب بـ PEG متغيرة، اعتماداً على عدة عوامل. ومع ذلك، من مستنبت بحجم 15 mL من سلالة B. burgdorferi CA-11.2A المحفزة، تحتوي 500 µL عادةً على 50-1,000 عاثية حيوية. إن أحجام استعادة العاثيات التي تبلغ ≥500 µL تؤثر سلباً على نمو B. burgdorferi، ويرجع ذلك على الأرجح إلى زيادة نسبة وسط التعليق (SM) إلى وسط BSK.
4. قم بإجراء اختيار الخلايا المنقولة عن طريق الزرع على وسط صلب بعد الخلط مع العاثيات المرسبة بـ PEG.

2. اختيار الخلايا المنقولة جينياً

ملاحظة: يتم إجراء الزرع في الطور الصلب للمنقولات المحتملة باستخدام تعديل أحادي الطبقة للبروتوكول. تنمو مستعمرات B. burgdorferi داخل الآجار، لذا لاختيار المنقولات عن طريق الزرع في الطور الصلب، يجب إضافة العينات إلى الأوساط أثناء صب الأطباق. قد تكون هذه التقنية فعالة أيضاً لاختيار المنقولات، ولكن لم يتم تجربتها لهذا الغرض بعد.

1. حدد عدد الأطباق اللازمة لاختيار المتحولات بناءً على عدد العينات من فحوصات التنقيل والضوابط المراد صبها.
   ملاحظة: عادةً ما يتم صب طبقين لكل عينة، أحدهما يعادل حوالي 10% من حجم المزرعة والآخر يتضمن المتبقي من المزرعة. بالإضافة إلى ذلك، قم بصب أطباق تعمل كضوابط سلبية لاختبار ما إذا كان تحضير الفاج و/أو المستنسخات الأصلية المستخدمة كمتبرع ومستقبل تنمو في وجود المضاد (المضادات) الحيوية المستخدمة أثناء الاختيار. يُوصى أيضًا بتحضير مواد صب لما لا يقل عن طبقين إضافيين. على سبيل المثال، إذا كان عدد العينات والضوابط المراد صبها ثمانية، فقم بتحضير خليط صب يكفي لـ 10 أطباق.
2. قم بتحضير محاليل الصب كما هو موضح أدناه.
   ملاحظة: سيكون حجم كل طبق 30 mL، ويتكون من 20 mL من 1.5x BSK للصب و 10 mL من 2.1% agarose (بنسبة 2:1). سينتج عن ذلك طبق بتركيزات نهائية قدرها 1x BSK و 0.7% agarose. على سبيل المثال، لـ 10 أطباق، قم بتحضير خليط صب إجمالي بحجم 300 mL، يتكون من 200 mL من 1.5x BSK و 100 mL من 2.1% agarose.
   1. قم بتحضير 1 L من 1.5x BSK باستخدام كميات كل مكون مدرجة لـ 1.5x BSK. يتم التخزين كما هو موضح لـ 1x BSK.
   2. قم بتحضير 2.1% agarose في الماء وعقمه بالأتوكلاف. استخدم محلول agarose طازجاً أو خزنه في درجة حرارة الغرفة. إذا تم تخزينه في درجة حرارة الغرفة، فقم بتسخينه في الميكروويف مع وضع الغطاء بشكل فضفاض حتى ينصهر تماماً قبل الصب.
   3. حدد حجم المضاد (المضادات) الحيوية اللازم لتحقيق التركيز المناسب بناءً على خليط الصب بالكامل.
      ملاحظة: إذا كان الحجم الإجمالي لمحلول الصب النهائي هو 300 mL، اخلط 200 mL من 1.5x BSK وكمية كافية من المضاد الحيوي لضمان أن يكون لإجمالي الـ 300 mL تركيز المضاد الحيوي النهائي الصحيح. إذا كان كل من المتبرع والمستقبل في فحص التنقيل يمتلكان جينات مقاومة لمضادات حيوية مختلفة، فيجب أن يحتوي خليط الصب على كلا المضادين الحيويين. أما إذا كان الفاج المرسب بـ PEG من المتبرع يشفر علامة مقاومة لمضاد حيوي وكان المستقبل لا يملك أي علامة، فيجب أن يحتوي خليط الصب على مضاد حيوي واحد فقط.
3. بناءً على عدد الأطباق المراد صبها، انقل الكمية المناسبة من 1.5x BSK والمضاد (المضادات) الحيوية إلى زجاجة معقمة كبيرة بما يكفي لاستيعاب خليط الصب بالكامل. يتم موازنة الحرارة في حمام مائي عند 56 °C لمدة ≥15 min.
4. قم بموازنة حرارة agarose المنصهر من الأتوكلاف أو الميكروويف في حمام مائي عند 56 °C لمدة ≥15 min.
5. بعد موازنة الحرارة، أضف الكمية المحددة من 2.1% agarose إلى الزجاجة التي تحتوي على 1.5x BSK (مع المضاد الحيوي) وأعد محلول الصب إلى الحمام المائي عند 42 °C لمدة 10-15 min.
   ملاحظة: يمكن أن تؤدي درجات الحرارة المرتفعة إلى إتلاف أو قتل السبيروخيتات36. في حال استخدام نفس الحمام المائي المذكور أعلاه، قم بتبريد الحمام المائي إلى 42-45 °C قبل بدء توقيت موازنة الحرارة. لا تترك محلول الصب يتوازن عند 42 °C لأكثر من 20 min وإلا سيبدأ في التصلب أثناء صب الأطباق.
6. أثناء موازنة الحرارة، قم بتحضير عينات B. burgdorferi المراد صبها. انقل الكمية المراد صبها إلى أنبوب طرد مركزي مخروطي معقم سعة 50 mL.
7. إذا كنت تصب كمية أقل من 1.5 mL (<5% من الحجم النهائي للطبق البالغ 30 mL)، فانقل العينة إلى الأنبوب الجديد وأضف خليط الصب مباشرة إلى العينة أثناء الصب.
   1. بالنسبة للأحجام الأكبر، انقل الحجم المطلوب من المزرعة إلى الأنبوب الجديد ثم قم بالطرد المركزي عند 6,000 x g لمدة 10 min في درجة حرارة الغرفة. اسكب كل السائل الطافي باستثناء 100-500 µL واستخدم المتبقي لإعادة تعليق الراسب تماماً قبل الصب.
   2. بالنسبة لأطباق الضوابط بعد الزراعة المشتركة، أضف ≥107 من خلايا المستنسخات المتبرعة أو المستقبلة إلى أنابيب طرد مركزي مخروطية معقمة سعة 50 mL. إذا كان الحجم يتجاوز 1.5 mL، قم بالطرد المركزي وأعد تعليق الراسب. إذا تم إجراء فحص تنقيل باستخدام الفاج المرسب بـ PEG، فبالإضافة إلى المستنسخ المستقبل، أضف 100-250 µL من عينة الفاج في أنبوب مخروطي معقم سعة 50 mL للصب.
8. بعد موازنة حرارة محلول الصب عند 42-45 °C لمدة 10-15 min، انقل 30 mL من محلول الصب إلى أنبوب يحتوي على العينة المناسبة؛ ثم صب خليط الصب والعينة فوراً في طبق مُسمى. كرر العملية باستخدام ماصة جديدة لكل عينة سيتم صبها.
9. اترك الأطباق تتصلب لمدة 15-20 min ثم ضعها في حاضنة عند 33 °C مدعمة بـ 5% CO₂. لا تقلب الأطباق لمدة 48 h على الأقل بعد صبها.
10. بناءً على خلفية المستنسخ المستقبل، تحقق من ظهور المستعمرات داخل agarose في أطباق الاختيار بعد 10-21 يوماً من التحضين. التقط ما لا يقل عن 5-10 مستعمرات نمت على الطبق في وجود كلا المضادين الحيويين باستخدام ماصة بوروسيليكات بطول 5.75 in ذات سدادة قطنية معقمة، وقم بتلقيحها في 1.5 mL من 1x BSK مع المضاد (المضادات) الحيوية المناسبة.
11. قم بتنمية المستعمرات الملقحة عند 33 °C لمدة 3-5 أيام أو حتى تصل إلى كثافة تقريبية تبلغ 20-40 سبيروخيت لكل حقل عند تكبير 200x باستخدام مجهر الحقل المظلم.
    ملاحظة: بمجرد فحص السبيروخيتات، يمكن تجميدها للتخزين طويل الأمد عند −80 °C عن طريق خلط حجم مساوٍ من المزرعة مع خليط من 60% glycerol و 40% 1x BSK معقم بالترشيح عبر مرشح 0.22 µm.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
أنابيب طرد مركزي مخروطية سعة 15 mL (بولي بروبيلين)	USA Scientific	5618-8271
Mitomycin C	Thermo Fisher Scientific	BP25312	تنبيه: مادة مسرطنة محتملة؛ تُستخدم فقط في خزانة استنشاق كيميائية
ماصات باستور 5.75" (بسدادة قطنية/زجاج بوروسيليكات/غير معقمة)	Thermo Fisher Scientific	13-678-8A	تُعقم بجهاز الأوتوكلاف قبل الاستخدام
أنابيب طرد مركزي مخروطية سعة 50 mL (بولي بروبيلين)	USA Scientific	1500-1211
إيثانول مطلق
Erythromycin	Research Products International Corp	E57000-25.0
محلول كاشف Gentamicin	Gibco	15750-060
جلوكوز (دكستروز لامائي)	Thermo Fisher Scientific	BP350-500
HEPES	Thermo Fisher Scientific	BP310-500
Kanamycin sulfate	Thermo Fisher Scientific	25389-94-0