نقل الجينات إلى عضوانيات الأمعاء الفأرية باستخدام النواقل الفيروسية البطيئة

الملخص

المصدر: Van Lidth de Jeude, J. F., et al. بروتوكول لنقل الفيروسات lentiviral والتحليل اللاحق للعضويات المعوية. J. Vis. Exp. (2015)

يصف هذا الفيديو عملية عفن الفيروسات lentiviral لعضوانيات الأمعاء الفأرية من معلق يحتوي على بنية شبيهة بالخبايا. وباستخدام مصفوفة الغشاء القاعدي كدعامة وأوساط مضاف إليها عوامل النمو، يتم إدخال ناقلات lentiviral لتمكين التكامل الجيني المستقر

البروتوكول

نقل الجينات بواسطة الفيروسات lentiviral إلى العضوانيات

اليوم 0:

1. قم بتقسيم بئر ممتلئ بمساحة 0.95 سم² من العضويات² بئر من العضوانيات قبل يومين من عملية التنبيغ في بئر جديدة، وذلك بهدف الحصول على 50 عضوانية صغيرة تقريباً. قم بتقسيم العضوانيات (الشكل 1-أ، ب).
2. أضف إلى وسط استزراع العضوانيات 10 µM Chir9021 و10 مللي مولار من النيكوتيناميد للحصول على خبيئات كيسية مفرطة التكاثر (الشكل 1ج).
   ملاحظة: تطور الخبايا الكيسية بشكل أفضل عندما تُنمى العضويات المنقسمة حديثاً في وجود Chir9021.

اليوم 2:

3. يتم حصاد العضوانيات (organoids) عن طريق سحب الـ matrigel والوسط للأعلى وللأسفل باستخدام الماصة الدقيقة p10، مما يؤدي إلى تفتيت الخليط. يوضع الخليط في أنبوب سعة 15 mL.
4. يتم التفتيت بشكل أكبر باستخدام ماصة باستور (Pasteur pipette) تم تقليل فتحتها البعيدة عن طريق الصهر. تُطرد العضوانيات مركزياً لتكوين كرة (pellet) لمدة 5 min عند 10 x g.
   ملاحظة: بناءً على حجم جهاز الطرد المركزي، يتم استخدام سرعة طرد مركزي مختلفة. من الضروري تحديد السرعة الدقيقة التي تنفصل عندها العضوانيات المفتتة عن الخليط.
5. يُزال الراشح (supernatant) ويُضاف 50 µL من trypsin 1x المسخن مسبقاً (مشابه لـ trypsin 0.25%). يتم إعادة تعليق العضوانيات في trypsin وتحضينها لمدة 3 min في حمام مائي عند 37 °C.
6. يتم تثبيط trypsin بإضافة 3.5 mL من وسط استزراع الخطوط الخلوية [وسط Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) مضافاً إليه 10% مصل عجلي جنيني (FCS)، و1% بنسيلين/ستربتومايسين وجلوتامين]. يُجرى الطرد المركزي لمدة 5 min عند 50 x g.
7. يُزال الراشح لترك كرة في حوالي 20 µL من الوسط. تُنقل العضوانيات في هذه الكمية الصغيرة الأخيرة من الوسط إلى بئر في طبق يحتوي على 48 بئراً.
8. يُضاف فيروس لينتي (lentivirus) عالي العيار في وسط ترانسدكشن (transduction medium)، ثم يُعاد التعليق والمتابعة إلى الخطوة 3.10 في حال مواجهة كفاءة ترانسدكشن منخفضة.
   ملاحظة: لتحقيق ترانسدكشن فعال، يُضاف عادةً مقياس واحد (aliquot) بحجم 250 µL من فيروس لينتي عالي العيار إلى بئر واحد من العضوانيات. يمثل هذا 50% من إجمالي فيروسات لينتي المحصودة من عملية إنتاج واحدة.
9. اختيارياً: لتعزيز كفاءة الترانسدكشن، يتم إجراء عملية spinoculation بوضع الطبق ذي الـ 48 بئراً الذي يحتوي على العضوانيات في جهاز طرد مركزي مسخن مسبقاً عند 32 °C، والتدوير عند 60 x g لمدة 1 hr.
10. يُوضع خليط العضوانيات والفيروس في حضانة استزراع ويُحضن لمدة 1 hr عند 37 °C في حضانة استزراع للسماح بعملية الترانسدكشن.
11. اختيارياً: لزيادة تعزيز كفاءة الترانسدكشن، تُحضن العضوانيات لمدة 3 hr إضافية عند 37 °C في حضانة استزراع.
12. يُضاف 1 mL من وسط استزراع العضوانيات ويُعاد تعليق خليط العضوانيات والفيروس، ثم يُنقل إلى أنبوب طرد مركزي دقيق ويُطرد مركزياً في جهاز طرد مركزي دقيق لمدة 5 min عند 850 x g لتكوين كرة من العضوانيات.
13. يُزال الراشح ويُعاد تعليق الكرة في 20 µL من Matrigel مبرد. نظراً لأن المادة تتصلب عندما تسخن، تُستخدم رؤوس ماصات مبردة عن طريق سحب PBS مبرد للأعلى وللأسفل عدة مرات.
14. توضع القطرة في منتصف بئر في طبق يحتوي على 48 بئراً وتُحضن في حضانة استزراع عند 37 °C لمدة 15 min حتى تتصلب.
15. بعد 15 min، يُضاف بحذر 250 µL من وسط استزراع العضوانيات المضاف إليه 10 mM nicotinamide و10 µM Chir9021 و10 µM Y27632. ستتشكل شظايا العضوانيات المفتتة الصغيرة إلى عضوانيات كيسية صغيرة خلال 24 hr.

اليوم 5:

16. قم بتجديد الوسط الغذائي وأضف مضادات حيوية اختيارية (بالنسبة للـ puromycin، استخدم 4 µg/mL).

اليوم 7:

1. استبدل الوسط بوسط استزراع العضوانيات القياسي، مضافاً إليه المضاد الحيوي الانتقائي.
   ملاحظة: سيكتمل التبرعم خلال 2-3 أسابيع بعد سحب Chir9021. بعد عملية الانتخاب، يمكن استزراع العضوانيات بدون المضادات الحيوية الانتقائية.

النتائج

الشكل 1: مخطط توضيحي لإنتاج الفيروسات البطيئة (lentivirus) من أجل تحويل العضوانيات.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
بولي إيثيلين إيمين	Polysciences	23966-2
وسط DMEM	Lonza	BE12-614F
مصل العجل الجنيني	Lonza	DE14-801F
بنسلين-ستريبتومايسين	Invitrogen	15140-122
جلوتامين	Invitrogen	25030-024
ماتريجيل (Matrigel)	نقل الجينات بواسطة الفيروسات البطيئة إلى العضوانيات اليوم 0: قبل يومين من عملية نقل الجينات، يتم تقسيم العضوانيات الموجودة في بئر كامل بمساحة 0.95 سم² إلى بئر جديد، بهدف الحصول على 50 عضوانية صغيرة تقريبًا. يتم تقسيم العضوانيات (الشكل 1A، B). يُضاف إلى وسط استزراع العضوانيات 10 ميكرومولار من Chir9021 و10 ميلي مولار من النيكوتيناميد للحصول على خبيات مفرطة التكاثر كيسية (الشكل 1C). ملاحظة: تتطور الخبيات الكيسية بشكل أفضل عندما تُنمى العضوانيات المقسمة حديثًا في وجود Chir9021. اليوم 2: تُجمع العضوانيات عن طريق السحب والتفريغ بالماصة لخليط الماتريجيل والوسط، مما يؤدي إلى تفكيك الخليط باستخدام ماصة دقيقة p10. يُوضع الخليط في أنبوب سعة 15 مل. يُجرى مزيد من التفكيك باستخدام ماصة باستور تم تضييق فتحتها البعيدة عن طريق الصهر. تُفصل العضوانيات بجهاز الطرد المركزي لترسيبها لمدة 5 دقائق عند 10 x g. ملاحظة: اعتمادًا على حجم جهاز الطرد المركزي، تُستخدم سرعة طرد مركزي مختلفة؛ فمن الضروري تحديد السرعة الدقيقة التي تنفصل عندها العضوانيات المفككة عن الخليط. يُزال السائل الطافي ويُضاف 50 ميكرولتر من التريبسين 1x المُسخن مسبقًا (مشابه لتريبسين بتركيز 0.25%). تُعلق العضوانيات في التريبسين وتُحضن لمدة 3 دقائق في حمام مائي عند درجة حرارة 37 درجة مئوية. يتم تثبيط نشاط التريبسين بإضافة 3.5 مل من وسط استزراع الخطوط الخلوية [وسط دولبيكو المعدل (DMEM) مضاف إليه 10% من مصل العجل الجنيني (FCS)، و1% بنسيلين/ستربتومايسين وجلوتامين]. يُجرى الطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 50 x g. يُزال السائل الطافي لترك راسب في حوالي 20 ميكرولتر من الوسط. تُنقل العضوانيات في هذه الكمية الضئيلة الأخيرة من الوسط إلى بئر في طبق يحتوي على 48 بئرًا. يُضاف فيروس بطيء عالي العيار في وسط نقل الجينات، وتُعلق العضوانيات ثم يُنتقل إلى الخطوة 3.10 عند مواجهة انخفاض في كفاءة نقل الجينات. ملاحظة: من أجل نقل جينات فعال، تُضاف عادةً حصة واحدة قدرها 250 ميكرولتر من الفيروس البطيء عالي العيار إلى بئر واحد من العضوانيات، وهو ما يمثل 50% من إجمالي الفيروسات البطيئة التي تم جمعها من إنتاج واحد. اختياريًا: لتعزيز كفاءة نقل الجينات، يتم إجراء عملية التدوير بالمركز (spinoculation) عن طريق وضع طبق الـ 48 بئرًا الذي يحتوي على العضوانيات في جهاز طرد مركزي مُسخن مسبقًا عند 32 درجة مئوية، والتدوير عند 60 x g لمدة ساعة واحدة. يُوضع خليط العضوانيات والفيروس في حاضنة استزراع وتُجرى الحضانة لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية للسماح بنقل الجينات. اختياريًا: لزيادة تعزيز كفاءة نقل الجينات، تُحضن العضوانيات لمدة 3 ساعات إضافية عند 37 درجة مئوية في حاضنة الاستزراع. يُضاف 1 مل من وسط استزراع العضوانيات ويُعاد تعليق خليط العضوانيات والفيروس، ثم يُنقل إلى أنبوب طرد مركزي دقيق ويُفصل في جهاز طرد مركزي دقيق لمدة 5 دقائق عند 850 x g لترسيب العضوانيات. يُزال السائل الطافي ويُعاد تعليق الراسب في 20 ميكرولتر من الماتريجيل المبرد بالثلج. وبما أن المادة تتصلب عندما ترتفع درجة حرارتها، تُستخدم رؤوس ماصات مبردة عن طريق سحب وتفريغ محلول PBS المبرد بالثلج عدة مرات. توضع القطرة في منتصف بئر في طبق 48 بئرًا وتُحضن في حاضنة استزراع عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة حتى تتصلب. بعد 15 دقيقة، يُضاف بعناية 250 ميكرولتر من وسط استزراع العضوانيات المضاف إليه 10 ميلي مولار نيكوتيناميد، و10 ميكرومولار Chir99021، و10 ميكرومولار Y27632. ستتشكل شظايا العضوانيات الصغيرة المفككة إلى عضوانيات كيسية صغيرة في غضون 24 ساعة. اليوم 5: يُجدد الوسط ويُضاف إليه مضاد حيوي انتقائي (في حالة البوروميسين، يُستخدم تركيز 4 ميكروغرام/مل). اليوم 7: يُستبدل الوسط بوسط استزراع العضوانيات القياسي، مضافًا إليه المضاد الحيوي الانتقائي. ملاحظة: يكتمل التبرعم بعد 2-3 أسابيع من سحب Chir9021. بعد عملية الانتخاب، يمكن تنمية العضوانيات بدون المضادات الحيوية الانتقائية.	BD 356231
وسط DMEM-F12 المطور	Gibco	12634-010
N2	Invitrogen	17502-048
B27	Invitrogen	17504-044
إن-أسيتيل سيستئين	سيجما	A9165-1G
عامل نمو البشرة (Egf) للفئران	Invitrogen	PMG8045
هيبس 1 مولار	Invitrogen	15630-056
جلوتامكس (Glutamax) تركيز 10x	Invitrogen	35050-038
Chir 99021	المحوار	1386
Y27632	سيجما	Y0503-5MG
بوليبرين	سيجما	107689
نيكوتيناميد	سيجما	N0636
تريبسين	Lonza	BE02-07E