الكشف عن تفعيل مسار SMAD باستخدام نقل جيني مزدوج بالفيروس الغدي

الملخص

المصدر: Chen, H., et al. تصوير الخلايا الحية لمسار إشارات TGF-β/Smad3 في المختبر وفي الكائن الحي باستخدام نظام مراسل للفيروس الغدي. J. Vis. Exp. (2018).

يوضح هذا الفيديو طريقة لدراسة تفعيل مسار SMAD في خلايا سرطان الثدي باستخدام العدوى الفيروسية الغدية المزدوجة. يقوم أحد الفيروسين بنقل جين GFP المعبر عنه بشكل مستمر، بينما يحمل الفيروس الآخر مراسل RFP تحت محفز حساس لـ SMAD. وعند تحفيز TGF-beta، يتم تفعيل بروتينات SMAD، مما يؤدي إلى تكوين معقد يحفز تعبير RFP. ويؤكد الكشف عن الإشارات المزدوجة في الخلايا الحية تفعيل المسار.

البروتوكول

1. ترنسدكشن مزدوج بالفيروسات الغدانية في الخلايا المفردة الحية

1. قم بزراعة 1.0 - 1.5 x 10⁵ من خلايا MDA-MB-231 مع 500 μL من وسط زراعة dulbecco’s modified eagle medium (DMEM) المحتوي على 5% من مصل الجنين البقري (FBS) في كل بئر من طبق يحتوي على 12 بئراً (بنسبة تلاقي خلوي 35%، وبإجمالي بئرين).
2. قم بإصابة الخلايا بـ 75 μL من الناقل adenoviral vector Ad-CMV-GFP (بتركيز titer = 5 x 10⁹ PFU/mL) و 7.5 μL من الناقل adenoviral vector Ad-CAGA12-Td-Tom (بتركيز titer = 5 x 10¹⁰ PFU/mL) للحصول على تعدد عدوى (MOI) يبلغ 2,50، وهو ما يمكن أن يحقق إيجابية إصابة بنسبة 10%.
3. عالج الخلايا بـ 0.25 μL من عامل النمو التحويلي بيتا (TGF-β) أو بدون إضافة لكل بئر (بتركيز 10 mg/mL في المحلول المخزون، و 5 ng/μL كتركيز نهائي) فور الانتهاء من الإصابة بالفيروس الغداني.
4. ضع الطبق في الحاضنة عند 37 °C مع 10% CO₂ لمدة 24 h.
5. صوّر الخلايا الحية باستخدام مجهر فلوري بتباين طوري. قم بإثارة البروتين الفلوري الأخضر (GFP) عند 470 nm وبروتين Td-Tomato عند 54 nm.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
DMEM	ThermoFisher	181024	يُدفأ في حمام مائي عند 37 °C قبل الاستخدام
مصل جنين البقر	Scientifix Life	FBS500-S	يُثبط حرارياً قبل الاستخدام
TGF-β1 البشري المؤتلف	PEPROTECH	10-21	يُقسم إلى حصص في DDW للحصول على تركيز نهائي قدره 10 mg/mL
مجهر فلوري تبايني الأطوار	OLYMPUS	IX50
MDA-MB-231	ATCC	CRM-HTB-26
المحلول			التركيب
FBS-DMEM			5% مصل جنين البقر FBS مثبط حرارياً؛ 10 μg/mL بنسلين؛ 100 μg/mL ستربتومايسين