التصوير الفلوري المتعدد للأحماض النووية الفيروسية والبروتينات في الخلايا اللمفاوية البشرية المصابة

الملخص

المصدر: Shah, R., et al. التصوير الفلوري المتعدد للخلية الواحدة لتصور الأحماض النووية والبروتينات الفيروسية ومراقبة العدوى بفيروسات HIV و HTLV و HBV و HCV وفيروس زيكا والإنفلونزا. J. Vis. Exp. (2020)

يوضح هذا الفيديو التصوير المتزامن للحمض النووي DNA، والحمض النووي RNA، وبروتين القفيصة للفيروس HIV-1 في اللمفاويات البشرية المصابة باستخدام تهجين DNA المتفرع والفلورة المناعية، مما يتيح تحليلاً مفصلاً لمراحل التكاثر الفيروسي داخل الخلايا الفردية.

البروتوكول

1. التلوين المناعي للبروتين: لوسم البروتين (أو البروتينات) المستهدفة

1. قم بتصفية محلول PBS (phosphate-buffered saline) وأضف 200 µL من محلول الحجب (1% w/v BSA (bovine serum albumin)، و10% v/v FBS (fetal bovine serum) في محلول PBS مع 0.1% v/v Tween-20 (PBST)) إلى غطاء الشريحة. احضن العينة لمدة 1 h في درجة حرارة الغرفة (RT).
2. قم بتصفية محلول الحجب وأضف 200 µL من الأجسام المضادة الأولية المخففة في PBST + 1% w/v BSA. احضن العينة لمدة 1 h في درجة حرارة الغرفة (RT).
3. اغسل الشريحة مرتين باستخدام PBST لمدة 10 min في درجة حرارة الغرفة (RT) مع الرج.
4. أضف الأجسام المضادة الثانوية المختارة لمدة 1 h في درجة حرارة الغرفة (RT) في محلول PBST + 1% w/v BSA.
5. اغسل الشريحة باستخدام PBST لمدة 10 min في درجة حرارة الغرفة (RT) مع الرج.

2. صبغ النواة: صبغ النوى تباينياً بعد الصبغ المناعي

1. قم بتصفية PBST وإضافة DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) أو صبغة نووية من اختيارك لمدة 1 min في RT.
2. اغسل الشريحة مرتين باستخدام PBS لمدة 10 min في RT مع الرج.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
Anti-HCV NS5a antibody	Abcam	ab13833	أجسام مضادة أحادية النسيلة من الفأر؛ تعمل مع الأنماط الجينية 1a و1b و3 و4 من HCV
Anti-HIV-1 p24 monoclonal antibody	NIH AIDS Reagent Program	3537
Anti-Mov10 antibody	Abcam	ab80613	أجسام مضادة متعددة النسيلة من الأرنب
Bovine serum albumin			كاشف حجب للتصبيغ المناعي
Cell media with supplements			وسط غذائي مناسب لنموذج الخلية
Coverslips
DAPI	ACD Bio		صبغة نووية (طقم RNAscope من ACD Bio)
Dulbecco's phosphate buffered saline (1X PBS)	Gibco	14190250	خالٍ من الكالسيوم والمغنيسيوم
Fetal bovine serum (FBS)			استخدم FBS محددًا بناءً على المصل الذي تم إنتاج الجسم المضاد الثانوي فيه (مثل FBS الماعز)
Fisherbrand colorfrost plus microscope slides	Fisher Scientific	12-550-17/18/19	منظفة مسبقًا
Slides
Tween-20			من أجل محلول تهجين DNA ومحلول PBS-T