تنقية أجسام الإنتاسوم للفيروس الرغوي النموذجي بواسطة كروماتوغرافيا الاستبعاد الحجمي

الملخص

المصدر: Mackler, R. M., et al. تجميع وتنقية الإنتاسومات الخاصة بالفيروس الرغوي النموذجي. J. Vis. Exp. (2018)

يوضح هذا الفيديو عملية تنقية الإنتازومات (intasomes) الخاصة بالفيروس الرغوي النموذجي (PFV) من معلق مختلط من البروتين والحمض النووي (DNA) باستخدام استخلاص الملح وكروماطوغرافيا استبعاد الحجم، مما ينتج عنه معقدات نشطة للتحليلات اللاحقة.

البروتوكول

1. إذابة الإنتاسوم

1. قم بتحضير طرفي ماصة واسعي التجويف عن طريق إزالة 2-4 مم من طرف ماصة سعة 20 µL باستخدام شفرة حلاقة أو مشرط جديد على سطح نظيف.
   ملاحظة: ستُستخدم هذه الأطراف في الخطوتين 1.3 و1.5.
2. أخرج أنبوب الديلزة من محلول الديلزة. ولمنع تخفيف عينة الإنتاسوم بمحلول الديلزة الذي قد يتبقى في نهاية الأنبوب بالقرب من المشبك، استخدم ماصة دقيقة ذات طرف صغير لإزالة أي محلول ديلزة زائد. ثم قم بإزالة المشبك من أحد طرفي أنبوب الديلزة.
3. استخدم طرف ماصة واسع التجويف من الخطوة 1.1 لنقل العينة، بما في ذلك الراسب الموجود داخل أنبوب الديلزة، إلى أنبوب سعة 1.5-mL على الثلج. 
   ملاحظة: يبلغ الحجم الإجمالي للمادة المستعادة عادةً ~140 µL.
4. تكون العينة التي تحتوي على الراسب بتركيز 20 mM NaCl؛ ارفع تركيز الملح إلى تركيز نهائي قدره 320 mM NaCl بإضافة الحجم المناسب من محلول NaCl المخزون بتركيز 5 M. على سبيل المثال، لعينة حجمها 150 µL، أضف 3.9 µL من 5 M NaCl و1.1 µL من ddH₂O ليصل الحجم النهائي إلى 15 µL. انقل وعاء الثلج الذي يحتوي على العينة إلى غرفة تبريد عند 4 ˚C.
5. استخدم طرف ماصة واسع التجويف من الخطوة 1.1 لإعادة تعليق وإذابة الراسب عن طريق السحب والضخ بالماصة. كرر العملية كل 20 دقيقة لمدة ساعة واحدة على الأقل. لاحظ أن معظم الراسب يجب أن يذوب في المحلول.
   ملاحظة: يمكن التوقف عن عملية السحب والضخ لإعادة تعليق الراسب عندما يتضح أن كمية الراسب لم تعد تتناقص بشكل ملحوظ بين الفترات الزمنية. عندما يكون الحمض النووي الفيروسي (vDNA) غير معلم أو معلمًا داخليًا، يتناقص الراسب بنسبة ~90% بناءً على الفحص البصري. وفي حالة vDNA المعلم عند الطرف بـ Cy5، يتناقص الراسب بنسبة ~20% فقط؛ حيث إن معظم الراسب في vDNA المعلم عند الطرف بفلوروفور لن يذوب. وتعتبر كمية الراسب التي تذوب فعليًا متغيرة ويجب تحديدها تجريبيًا.

2. تنقية الـ Intasome

1. قم بتحضير 250 mL من محلول التشغيل لكروماتوغرافيا استبعاد الحجم (SEC) (20 mM Bis-tris propane، pH 7.5، 320 mM NaCl، 10% glycerol). قم بترشيح المحلول تعقيمياً باستخدام وحدة ترشيح 0.2-µm واحفظه عند 4 ˚C.
   ملاحظة: تُجرى جميع خطوات التنقية في غرفة باردة عند 4 ˚C.
2. قم بموازنة عمود SEC من الأغاروز المتشابك (القطر = 10 mm؛ الطول = 30 mm؛ حجم الحشوة = 24 mL؛ حجم العينة = 25 - 50 µL؛ أقصى ضغط = 1.5 MPa؛ حد الاستبعاد = 4 x 10⁷ Da؛ يفصل الأوزان الجزيئية بين 5 و 5,00 kDa، انظر جدول المواد) باستخدام محلول تشغيل SEC بمعدل تدفق 0.4 mL/min.
   ملاحظة: يمكن تكييف عملية التنقية هذه مع أعمدة استبعاد حجم مختلفة إذا كانت قادرة على فصل 30 kDa عن 4 kDa بشكل فعال، مثل Superose 12 10/30 GL أو Superose 6 Increase. يتميز Superose 12 10/30 GL بدقة أقل، مما يؤدي إلى تداخل أكبر في القمم. وعلى العكس من ذلك، يتميز Superose 6 Increase بدقة أعلى ويوفر فصلاً أفضل.
3. قم بطرد عينة الـ intasome مركزياً في جهاز طرد مركزي دقيق عند 14,00 x g لمدة 10 min عند 4 ˚C لترسيب أي رواسب متبقية. قم بإزالة السائل الطافي بعناية. قم بتحميل السائل الطافي في حلقة حقن سعة 20 µL (أنبوب يمكنه استيعاب ~20 μL). ثم ضع العينة في عمود SEC.
   ملاحظة: تسمح أحجام التحميل الأصغر بدقة أعلى في تقنية SEC.
4. قم بعملية الشطف باستخدام 25 mL من محلول تشغيل SEC واجمع 95 جزءاً بحجم 270 µL لكل جزء. لاحظ أن مخطط كروماتوغرافيا SEC يظهر ثلاث قمم A₂₈₀/A₂₆₀ (الشكل 1).
   ملاحظة: يجب أن تكون القمة الأولى عبارة عن تجمعات (~9.0 - 1.5 mL شطف)، تليها قمة الـ PFV tetramer intasome (~12.0 - 14.75 mL شطف)، ثم قمة PFV IN monomer مع vDNA الحر (~15.0 - 18.0 mL).

النتائج

الشكل 1: كروماتوغرام استبعاد الحجم. تم فصل تجمع intasome لفيروس PFV باستخدام عمود SEC من الأغاروز. يتيح هذا العمود فصل التجمعات (1)، وintasome PFV الذي يتكون من رباعي من PFV IN وقطعتين من vDNA (2)، وPFV IN أحادي القيمة وvDNA (3). شمل هذا المثال vDNA يحمل علامة فلورية Cy5 داخلية تم الكشف عنها بواسطة استثارة بطول موجي 650 nm. يمثل المحور الصادي الكثافة الضوئية (OD) بوحدات امتصاص مللي (mAU).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
أوليغومرات DNA	IDT	N/A	أوليغومرات DNA مخصصة
NaCl	P212121	RP-S23020
BIS-TRIS propane,>=9.0% (titration)	Sigma-Aldrich	B675-50G
جلسرول	Thermo Fisher Scientific	G37-20
رؤوس ماصات تحميل الهلام، 1 - 20 μL	Corning	CLS4853-40EA
شفرة حلاقة؛ أحادية الحافة؛ 10/عبوة؛ عبوة من 10 قطعة	Fisher Scientific	12-640
مشابك أنابيب الديلزة	Spectrum Labs	132734
أنابيب ديلزة 6-8 kDa 10 mm	Spectrum Medical	132645
Superose 6 10/30 GL	GE Healthcare Life Sciences	17517201