استخلاص الحمض النووي الريبوزي الفيروسي لتحليله باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي (qPCR)

الملخص

المصدر: Suzuki, Y., et al. قياس RNA لفيروس dengue في السائل الطافي لمستنبت الخلايا المصابة باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي. J. Vis. Exp. (2018).

يوضح هذا الفيديو إجراء تحضير العينات الفيروسية لتحليل تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (Polymerase chain reaction). يتم تخفيف العينات الفيروسية ومعايير RNA تخفيفاً تسلسلياً، ومعالجتها بمحلول منظم من البروتيناز K، ثم تحضينها في درجات حرارة مضبوطة لتحرير RNA. بعد ذلك، يتم تثبيت RNA المعالج وتخزينه من أجل تقدير مستويات RNA الفيروسي كمياً.

البروتوكول

1. معالجة عينات الفيروس لإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي (RT-qPCR)**

ملاحظة: يجب تنفيذ الخطوات 1.1-1.3 داخل كبينة سلامة بيولوجية. وبشكل خاص، يجب إجراء التعامل مع الطافي المزرعي الذي يحتوي على فيروس معدٍ في بيئة بمستوى سلامة بيولوجية 2 (أو أعلى).

1. امزج 199 μL من محلول المعالجة المنظم و1 μL من البروتيناز K الخالي من النيوكلياز.
2. قم بتخفيف RNA (حمض ريبونوكلييك) المنطقة 3’UTR (المنطقة غير المترجمة) الاصطناعي لفيروس DENV (فيروس حمى الضنك) بتخفيف تسلسلي بنسبة 1:10 للحصول على معيار RNA يتراوح من 5 x 10⁹ إلى 5 x 10³ نسخة/μL باستخدام وسط زراعة الخلايا (على سبيل المثال، DMEM (وسط دولبكو المعدل من وسط إيجل) المكمل بـ 10% مصل جنين البقري ومضادات حيوية [DMEM/10% fetal bovine serum]) والذي يحتوي على 40 units/mL من مثبط RNase.
3. امزج 5 μL من supernatant المزرعة للخلايا المصابة بـ DENV ومعيار DENV 3’UTR RNA مع 5 μL من محلول محلول المعالجة المنظم/البروتيناز K باستخدام شرائح PCR (تفاعل البوليميراز المتسلسل) المكونة من 8 أنابيب أو لوحة PCR ذات 96 بئراً. وكعينة ضابطة خالية من القالب (NTC)، امزج 5 μL من وسط زراعة الخلايا (أي بدون إضافة فيروس) مع 5 μL من محلول محلول المعالجة المنظم/البروتيناز K.
4. بعد عملية طرد مركزي قصيرة، قم بحضن العينات في جهاز التدوير الحراري (thermocycler) وفقاً للشروط التالية: دورة واحدة (بدرجة حرارة 25 °C لمدة 10 min وبدرجة حرارة 75 °C لمدة 5 min).
ملاحظة: يمكن الاحتفاظ بالعينات المعالجة في درجة حرارة 4 °C إذا تم إجراء تحليل real-time PCR في اليوم نفسه. أما للتخزين طويل الأمد، فيجب تخزين العينات في درجة حرارة -80 °C.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
SimpliAmp Thermal Cycler	Thermo Fisher Scientific	A24811	يمكن استخدام جهاز دورات حرارية مماثل، ولكن يجب تحسين ظروف دورة PCR.
Recombinant RNase Inhibitor	Takara Bio. Inc	2313A	40 units/μL
RNeasy Mini Kit	Qiagen	74104	يمكن استخدام طقم تنقية RNA مماثل.
Proteinase K	Nacalai Tesque	15679-06	>600 units/mL. يمكن استخدام كاشف مماثل.
MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate, 0.1 mL	Thermo Fisher Scientific	4346907	يمكن استخدام لوحة أو أنبوب مماثل اعتماداً على جهاز real-time PCR، ولكن يجب تحسين ظروف دورة PCR.