حصاد جزيئات فيروس التهاب الكبد E من خلايا سرطان الكبد البشرية

الملخص

المصدر: Meister, T. L., et al. نموذج زراعة خلوية لإنتاج مخزونات عالية العيار من فيروس التهاب الكبد E. J. Vis. Exp. (2020).

يوضح هذا الفيديو عملية عزل جزيئات فيروس التهاب الكبد E (HEV) من خلايا سرطان الخلايا الكبدية البشرية المنقولة جينياً. يتم جمع الجزيئات الفيروسية خارج الخلوية من السوائل الطافية المُرشحة، بينما يتم تحرير الجزيئات داخل الخلوية عن طريق إخضاع الخلايا لدورات متكررة من التجميد والإذابة. يتم طرد المستخلص مركزياً، ثم تُقسم السوائل الطافية التي تحتوي على جزيئات HEV إلى حصص وتُخزن في درجة حرارة منخفضة للغاية لاستخدامها مستقبلاً

البروتوكول

1. تحضير خلايا HepG2 لإنتاج فيروس التهاب الكبد E المشتق من المزارع الخلوية (HEVcc)
ملاحظة: لتجنب التلوث، تم إجراء تحضير الخلايا، والتثقيب الكهربائي، والعدوى، والحصاد، وتثبيت الخلايا تحت ظروف معقمة في منشأة ذات مستوى أمان حيوي 2. أما خطوات الحضن عند 37 °C التي تشمل الخلايا فقد تم تنفيذها في حاضنة تحتوي على 5% CO₂.

1. لتحضير خلايا HepG2 لإنتاج HEVcc (الشكل 1)، يتم استزراع الخلايا في وسط Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) الكامل (راجع الجدول 1) في طبق استزراع بقطر 15 سم مغطى بالكولاجين (راجع الجدول 1، يتم ترشيح خليط المحلول الملحي المنظم بالفوسفات (PBS) وحمض الأسيتيك المعقم عبر مصفاة 0.2 µm قبل إضافة الكولاجين). يتم التحضين عند 37 °C حتى تصل الخلايا إلى درجة تلاقي 90%.
   ملاحظة: كل طبق بقطر 15 سم يحتوي على خلايا بنسبة تلاقي 90% سينتج عدداً كافياً من الخلايا لما يصل إلى 4 عمليات تثقيب كهربائي.
2. يُزال الوسط من الطبق برفق وتغسل الخلايا مرة واحدة بـ 10 mL من 1x PBS. يتم هضم الخلايا بالتربسين عن طريق إضافة 3 mL من 0.05% trypsin-EDTA إلى الخلايا والتحضين عند 37 °C حتى تنفصل الخلايا تماماً. تُعلق الخلايا مجدداً في 10 mL من وسط DMEM الكامل ويُنقل معلق الخلايا إلى أنبوب سعة 50 mL. يتم تحديد العدد الإجمالي للخلايا.
3. بما أن كل عملية تثقيب كهربائي تتطلب 5 x 10⁶ خلية، يتم نقل الحجم المناسب إلى أنبوب جديد سعة 50 mL ويُملأ حتى 35 mL على الأقل باستخدام 1x PBS. تُطرد الخلايا مركزياً عند 200 x g لمدة 5 min ويُتخلص من السائل الطافي بعناية دون تعكير قرص الخلايا.
4. تغسل الخلايا مرة أخرى بـ 35 mL من 1x PBS عند 200 x g لمدة 5 min. توضع الخلايا على الثلج ولا يتم إزالة 1x PBS بعد، وذلك للحفاظ على الخلايا في حالة تعليق.

2. التثقيب الكهربائي لخلايا HepG2

1. لإجراء التثقيب الكهربائي لخلايا HepG2 (الشكل 2)، قم بتحضير 400 µL من وسط Cytomix الكامل لكل عملية تثقيب كهربائي عن طريق إضافة 2 mM من ATP و5 mM من Glutathione إلى 384 µL من Cytomix (انظر الجدول 1). يتم التحضير مباشرة قبل الاستخدام ويوضع الخليط على الثلج.
   ملاحظة: يُعد التنفيذ الدقيق والسريع للخطوات التالية أمراً بالغ الأهمية؛ لذا تأكد من تحضير كل شيء بشكل صحيح.
2. أزل 1x PBS بعناية دون تعكير كتلة الخلايا الناتجة من الخطوة 4.4. أعد تعليق 5 x 10⁶ خلية في 400 µL من وسط Cytomix الكامل وأضف 5 µg من RNA. انقل المحلول إلى كوفيت سعة 4 mm وقم بإجراء نبضة واحدة بجهد 270 V وسعة 975 µF لمدة 20 ms باستخدام نظام التثقيب الكهربائي.
   1. بعد التثقيب الكهربائي، انقل الخلايا بأسرع ما يمكن باستخدام ماصة باستور إلى 11 mL من وسط DMEM الكامل لكل عملية تثقيب كهربائي.
      ملاحظة: للتأكد من نجاح عملية نقل RNA إلى خلايا HepG2، سيتم إجراء تحكم في عملية النقل (TC). تتراوح معدلات النقل المتوقعة بين 40-60% من الخلايا الموجبة لـ ORF2.
3. انقل 10 mL من الخلايا التي خضعت للتثقيب الكهربائي إلى طبق زراعة سعة 10 cm مطلى بالكولاجين. أضف 1.3 x 10⁵ من الخلايا المثقبة كهربائياً (300 µL) في بئر واحد من طبق معايرة دقيقة سعة 24 بئراً مطلى بالكولاجين ويحتوي على شريحة غطاء (تستخدم لاحقاً كتحكم في عملية النقل). وزع الخلايا بالتساوي واحضرها في درجة حرارة 37 °C.
   1. بعد 24 h، قم بتغيير الوسط في طبق الـ 10 cm واستبدله بـ 10 mL من وسط DMEM الكامل الطازج. لا تقم بتغيير الوسط الخاص بالتحكم في عملية النقل. احضرها لمدة 6 أيام أخرى في درجة حرارة 37 °C.

3. حصاد فيروس التهاب الكبد E المشتق من المزارع الخلوية (HEVcc) من داخل وخارج الخلايا

1. لحصاد HEVcc خارج الخلية (الشكل 3)، قم بترشيح السائل الطافي الذي تم الحصول عليه من طبق 10 cm بعد 6 أيام من خلال مصفاة 0.45 µm لإزالة أي حطام خلوي. قم بتخزين HEVcc خارج الخلية المحصود عند 4 °C في حال استخدامه للعدوى في نفس اليوم؛ وإلا فيتم تخزينه عند -80 °C.
2. لحصاد HEVcc داخل الخلية (الشكل 3)، اغسل الخلايا باستخدام 1x PBS وقم بمعالجتها بالتربسين عن طريق إضافة 1.5 mL من 0.05% trypsin-ethylenediamine tetraacetic acid (trypsin-EDTA). قم بالتحضين عند 37 °C حتى تنفصل الخلايا تماماً. أضف 10 mL من complete DMEM، واغسل الطبق لفصل الخلايا وانقل معلق الخلايا إلى أنبوب 50 mL. اغسل الخلايا مرتين باستخدام PBS. قم بالطرد المركزي عند 200 x g لمدة 5 min.
   1. تخلص من السائل الطافي وأعد تعليق كتلة الخلايا في 1.6 mL من complete DMEM لكل عملية تنبيه كهربائي. انقل معلق الخلايا إلى أنبوب تفاعل 2 mL.
      ملاحظة: لا تستخدم أحجاماً أكبر، لأن ذلك سيؤدي إلى انخفاض الحمل الفيروسي بشكل كبير.
   2. قم بتجميد الخلايا (في النيتروجين السائل) ثم إذابتها. كرر هذه التسلسل 3 مرات.
      ملاحظة: لا تدمج أكثر من عملية تنبيه كهربائي واحدة (1.6 mL) في دورات التجميد والإذابة الثلاث، لأن كفاءة التحلل ستتأثر. لا تقم برج معلق الخلايا بواسطة جهاز vortex بين الدورات. تأكد من إذابة معلق الخلايا ببطء (على سبيل المثال، في درجة حرارة الغرفة أو على الثلج) لزيادة الأحمال الفيروسية إلى أقصى حد.
   3. قم بالطرد المركزي عالي السرعة للخلايا المتحللة لمدة 10 min عند 10,000 x g لفصل الحطام الخلوي. انقل السائل الطافي إلى أنبوب جديد. استخدم السائل الطافي للعدوى؛ وإلا فقم بتخزينه عند -80 °C.
   4. اختيارياً، قم بتركيز HEVcc خارج وداخل الخلايا باستخدام جهاز تركيز لزيادة الأحمال الفيروسية.

الجدول 1: جدول تركيب المحلول المنظم.

المحلول العامل	التركيز	الحجم
كولاجين (Collagen)	40 mL	PBS
	40 µl	حمض الأسيتيك (Acetic acid)
	1 mL	محلول Collagen R معقم 0.4%
سيتوميكس (Cytomix)	120 mM	KCl
	0.15 mM	CaCl2
	10 mM	K2HPO4 (pH 7.4)
	25 mM	HEPES
	2 mM	EGTA
وسط DMEM كامل	500 mL	DMEM
	5 mL	Pen/Strep
	5 mL	MEM NEAA (100X)
	5 mL	L-Glutamin
	50 mL	مصل جنين البقر (Fetal bovine serum)
وسط MEM كامل	500 mL	MEM
	5 mL	بيروفات الصوديوم (Sodium pyruvate)
	5 mL	جنتاميسين (Gentamycin)
	5 mL	MEM NEAA (100X)
	5 mL	L-Glutamine
	50 mL	ultra-low IgG

النتائج

الشكل 1: مخطط تجريبي لتجهيز خلايا HepG2 لإنتاج فيروس التهاب الكبد E المشتق من المزارع الخلوية (HEVcc).

الشكل 2: مخطط تجريبي لإجراء عملية التثقيب الكهربائي لخلايا HepG2.

الشكل 3: مخطط تجريبي لإعداد عملية حصاد فيروس HEVcc داخل وخارج الخلايا.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
0.45 µm mesh	Sarstedt	83.1826	حصاد الفيروس خارج الخلية
MEM	gibco	31095-029	زراعة الخلايا
MEM NEAA (100×)	gibco	11140-035	زراعة الخلايا
Trypsin-EDTA (0.5 %)	gibco	15400054	زراعة الخلايا
ultra-low IgG	gibco	1921005PJ	زراعة الخلايا
Acetic acid	CarlRoth	6755.1	محلول الكولاجين العامل
ATP	Roche	11140965001	النسخ في المختبر والتثقيب الكهربائي
BioRender	BioRender		إنشاء الأشكال التوضيحية
Calcium chloride	Roth	5239.2	سيتوميكس (Cytomix)
Collagen R solution 0.4 % sterile	Serva	47256.01	محلول الكولاجين العامل
DMEM	gibco	41965-039	زراعة الخلايا
EGTA	Roth	3054.3	سيتوميكس (Cytomix)
GenePulser Xcell Electroporation System	BioRad	1652660	التثقيب الكهربائي
HEPES	Invitrogen	15630-03	سيتوميكس (Cytomix)
Di-potassium hydrogen phosphate	Roth	P749.1	سيتوميكس (Cytomix)
KCL	Roth	6781.3	سيتوميكس (Cytomix)
Potassium di-hydrogen phosphate	Roth	3904.2	سيتوميكس (Cytomix)
L-Glutamin	gibco	25030081	زراعة الخلايا
L-Glutathione reduced	Sigma-Aldrich	G4251-5G	سيتوميكس (Cytomix)
MEM	gibco	31095-029	زراعة الخلايا
MEM NEAA (100×)	gibco	11140-035	زراعة الخلايا
Magnesium chloride	Roth	2189.2	سيتوميكس (Cytomix)
Microvolume UV-Vis spectrophotometer NanoDrop One	Thermo Fisher	ND-ONE-W	تركيز DNA/RNA
PBS	gibco	70011051	زراعة الخلايا
Pen/Strep	Thermo Fisher	15140122	زراعة الخلايا