تنقية الفيروس من السائل السلوي لبيوض الدجاج الملقحة

الملخص

المصدر: Yates, J. G. E., et al. إنتاج فيروس مرض نيوكاسل المؤتلف عالي العيار من السائل السلوي. J. Vis. Exp. (2022)

يوضح الفيديو عملية تنقية وتركيز الجسيمات الفيروسية من السائل السلوي المصفى الذي تم جمعه من بيض الدجاج الملقح والمصاب بالفيروس. كما يستعرض سلسلة من خطوات الترشيح والفصل، بما في ذلك الترشيح العميق، والترشيح بالتدفق المماسي، والطرد المركزي الفائق بتدرج الكثافة لعزل الفيروسات السليمة. بعد ذلك، يتم إجراء ديالة للجزء الغني بالفيروسات لإزالة الأملاح المتبقية ومكونات التدرج عن طريق الانتشار، يليه التركيز باستخدام محلول عالي التوتر عبر الخاصية الاسموزية. والنتيجة هي مستحضر فيروسي منقى وعالي العيار مناسب للاستخدام التجريبي.

البروتوكول

1. تضخيم فيروس مرض نيوكاسل (NDV) باستخدام بيض دجاج ملقح خالي من مسببات أمراض محددة

1. تلقيح بيض الدجاج الملقح الخالي من مسببات الأمراض النوعية (SPF)
   ملاحظة: عادةً ما يتم استخدام ثماني دزينات من بيض الدجاج الملقح SPF لإنتاج دفعة واحدة من فيروس مرض نيوكاسل (NDV) بدرجة مناسبة للاستخدام داخل الجسم الحي. اطلب دزينة أو دزينتين إضافيتين من البيض لتعويض التلف أثناء الشحن، وكذلك التباين في الحيوية.
   1. بعد استلام بيض الدجاج الملقح SPF، قم بتحضينه في حاضنة بيض عند 37 °C ورطوبة 60% لمدة 9 أيام. تأكد من ضبط الحاضنة لتدوير/هز البيض تلقائيًا كل ساعة.
      ملاحظة: يمكن تخزين البيض في درجة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى 24 h أو عند 4 °C لمدة تصل إلى 72 h؛ ومع ذلك، قد يؤدي ذلك إلى انخفاض حيوية الجنين.
   2. بعد 8-11 أيام من التحضين (يفضل في اليوم التاسع)، يتم فحص البيض بالضوء (candling) لتحديد حيوية الجنين. ابحث عن الأوعية الدموية الشبيهة بالشبكة (الشكل 1A) وحركة الجنين كمؤشرات على الأجنة الحيوية. تخلص من البيض الذي يفتقر إلى هذه الميزات (الشكل 1B).
   3. على البيض الحي، حدد الواجهة بين الغشاء الهوائي والجنين بقلم رصاص بعلامة 'X' (الشكل 1A). تأكد من أن موقع الحقن هذا لن يتسبب في ثقب الأوعية الدموية. أعد البيض المحدّد إلى الحاضنة أثناء تحضير اللقاح.
   4. احسب كمية الفيروس المطلوبة لحقن جميع بيض الدجاج الملقح SPF. تأكد من أن كل بيضة تتلقى 100 وحدة تشكيل لوحة (PFU) من الفيروس في حجم 100 µL؛ خفف الفيروس في محلول ملحي منظم بالفوسفات (PBS) إلى تركيز 1 × 10³ PFU/mL. قم بتحضير 20% إضافية من اللقاح لتعويض عدم الدقة في إعطاء الفيروس.
   5. باستخدام منديل مضاد للاستاتيكية، نظف قمم البيض المحدّد بمحلول يود 10% مخفف في إيثانول 70%. انتظر لمدة 1-2 دقيقة تقريبًا حتى يجف المحلول.
   6. اثقب القشرة بعناية باستخدام ملقط معقم وحاد. قم بتعقيم الملقط في إيثانول 70% بين كل بيضة وأخرى.
   7. باستخدام محقنة 1 mL وإبرة 25 G، احقن 100 µL من اللقاح المحضر في الخطوة 1.1.4 في التجويف الكوري السلوي (الشكل 1C). اقترب بالإبرة بزاوية تقارب 90° من البيضة. أدخل الإبرة للتو في الجزء العلوي من الغشاء الكوري السلوي.
   8. بعد التلقيح، استخدم طلاء الأظافر لتغطية موقع الثقب وأعد البيض إلى الحاضنة. تأكد من أن إعداد الهز (rocking) في وضع التشغيل (ON) حتى 24 h بعد التلقيح.
   9. تحقق من حيوية البيض بعد 24 h من التلقيح. تخلص من البيض الميت الذي يفتقر إلى الأوعية الدموية في الغشاء الكوري السلوي وحركة الجنين (الشكل 1B).
      ملاحظة: مات هذا البيض بسبب عملية التلقيح وليس بسبب NDV.
   10. أعد البيض إلى الحاضنة، مع ضبط وضع الهز على الإيقاف (OFF) لمنع تلوث السائل السلوي ببروتينات البيض.
   11. افحص البيض كل 12-24 h كما هو موضح في الخطوة 1.1.9 لتحديد البيض الميت. انقل البيض الذي يموت بعد 24 h من التلقيح إلى 4°C لتقليل التحلل الذاتي. اجمع السائل السلوي في غضون 2-12 h من التبريد.
   12. حضن البيض لمدة 72 h على الأقل.
       ملاحظة: عند إكثار سلالة ميزوجينية (mesogenic) من NDV، يكون وقت التحضين الأمثل 60-72 h، حيث أن أوقات التحضين الطويلة يمكن أن تعيق عملية التنقية بسبب انخفاض نقاء السائل السلوي. هذه المشكلة ليست ذات أهمية كبيرة عند إكثار سلالات NDV لينتوجينية (lentogenic)، لأنها تستغرق وقتًا أطول بكثير لقتل الجنين.
   13. بعد فترة التحضين المناسبة، انقل البيض المتبقي إلى 4 °C لمدة 2-12 h قبل جمع السائل السلوي.
2. جمع السائل السلوي المحتوي على NDV
   1. انقل البيض المبرد إلى كابينة السلامة البيولوجية. نظف قمم البيض بإيثانول 70%.
   2. استخدم ملقطًا معقمًا ومقصًا جراحيًا لفتح الجانب القمي للبيضة حيث يقع الغشاء الهوائي.
   3. أزل القشرة للكشف عن الغشاء الكوري السلوي (الشكل 1D).
   4. اثقب الغشاء بعناية وقشره للخلف لكشف التجويف السلوي (الشكل 1E). تأكد من عدم ثقب كيس المح الناجم عن الخطأ، لأن ذلك سيؤدي إلى إتلاف البيضة.
   5. استخدم ملقطًا غير مدبب للإمساك بالجنين وفتح الكيس الجنيني.
      ملاحظة: السائل الموجود داخل الكيس الجنيني يحتوي أيضًا على NDV.
   6. اضغط على الجنين باستخدام الملقط واجمع السائل السلوي باستخدام ماصة سيرولوجية 10 mL.
   7. خزن السائل السلوي على الثلج في أنابيب مخروطية 15 mL حتى عملية الترويق.
      ملاحظة: إذا كان السائل السلوي أصفر اللون، فهذا يعني أن كيس المح قد تضرر، ويجب التخلص من السائل السلوي.
   8. قم بطرد مركزي للأنابيب المخروطية التي تحتوي على السائل السلوي عند 1,500 × g لمدة 10 min عند 4 °C.
   9. نقطة توقف: قسم السائل السلوي المروق إلى أنابيب مخروطية 50 mL وخزنها عند -80 °C للتخزين طويل الأمد (على سبيل المثال، أسابيع إلى أشهر)، مع تدعيم السائل بالسكروز إلى تركيز نهائي 5% لحماية الفيروس من الآثار القاسية للتجميد والذوبان. بدلاً من ذلك، للتخزين قصير الأمد (على سبيل المثال، 1-3 أيام)، دعّم السائل السلوي بالسكروز (نهائي 5%) أو بمحلول منظم Mannitol-Lysine (ML) بتركيز 3× (15% Mannitol، 3% Lysine) للحصول على تركيز نهائي 1× (5% Mannitol، 1% Lysine) قبل التخزين عند 4 °C.

2. تنقية فيروس مرض نيوكاسل (NDV) من سائل السقاء

1. الترشيح العميق لسائل السقاء
   1. يُحفظ سائل السقاء المصفى عند -80 °C ويُذاب عند 4 °C في الليلة السابقة لعملية التنقية.
   2. في كابينة السلامة البيولوجية، يتم تجهيز الأنابيب والمضخة التمعجية كما هو موضح في الشكل 2.
   3. إذا لم يتم ذلك بالفعل، اخلط سائل السقاء مع منظم ML بتركيز 3× ليصل إلى تركيز نهائي 1×.
   4. قبل تركيب المرشح العميق، يتم تعقيم الأنابيب بتمرير 50 mL من هيدروكسيد الصوديوم (NaOH) بتركيز 0.5 M عبر النظام إلى وعاء النفايات.
   5. اشطف الأنابيب بتمرير 100 mL من الماء المعقم ذي الدرجة الجزيئية عبر النظام وإلى وعاء النفايات.
      ملاحظة: بما أن NaOH سيؤدي إلى تثبيط فيروس NDV، فمن المهم غسل الخطوط بشكل كافٍ قبل إدخال سائل السقاء المحتوي على الفيروس.
   6. يتم تحضير النظام بتشغيل 50 mL من PBS عبره، مع إيقاف المضخة عندما يتبقى حوالي 5 mL من PBS في الأنبوب.
   7. قم بتركيب مرشح عميق بتصنيف احتجاز 1-3 µM في الأنابيب وأزل الغطاء الثاني من الجانب القمي للمرشح العميق لتنفيس المرشح. ابدأ بتشغيل 50 mL إضافية من PBS عبر النظام.
   8. بمجرد أن يبدأ PBS في التدفق عبر المنفذ في الجزء العلوي من المرشح، أغلق المنفذ واستمر في تدفق PBS عبر الخطوط.
      ملاحظة: الفقاعات الهوائية الصغيرة مقبولة، ولكن وجود كميات كبيرة من الهواء سيتطلب تنفيس المرشح مرة أخرى كما هو موضح في الخطوتين 2.1.7 و 2.1.8.
   9. أوقف المضخة عندما يتبقى حوالي 5 mL من PBS في الأنبوب.
   10. استبدل وعاء النفايات بوعاء تجميع معقم جديد وابدأ بتشغيل سائل السقاء عبر المرشح العميق.
       ملاحظة: يجب ألا يتجاوز الضغط 10 psi، لأن ذلك يؤدي إلى تمزق الفيروس. يمكن التحكم في الضغط عن طريق تقليل أو زيادة معدل تدفق المضخة. إذا بدأ الضغط في تجاوز 10 psi ولم يعد من الممكن تقليل معدل التدفق أكثر من ذلك، يجب استخدام مرشح عميق جديد. في هذه الحالة، يجب تنفيذ الخطوات من 2.1.6 إلى 2.1.8 قبل استئناف تدفق سائل السقاء.
   11. بمجرد مرور كل سائل السقاء عبر المرشح، قم بتمرير 50 mL من منظم ML بتركيز 1× عبر الخطوط لزيادة استعادة الفيروس إلى أقصى حد.
   12. اجمع السائل حتى تجف الخطوط. يُحفظ الفيروس طوال الليل أو لمدة تصل إلى 36 h عند 4 °C.
       ملاحظة: بمجرد ترشيح الفيروس عميقاً، تابع عملية التنقية في غضون 36 h من إتمام الترشيح العميق.
   13. افصل المرشح العميق وعقم الأنابيب بتمرير 100 mL من 0.5 M NaOH ومبيض بتركيز 400 جزء في المليون (ppm) مسخن مسبقاً إلى 42 °C عبر النظام قبل تخزينه في 0.5 M NaOH.
2. الترشيح بالتفق التدفيقي لتركيز NDV
   1. قم بتجميع مكونات الكاسيت كما هو موضح في الشكل 3A في كابينة السلامة البيولوجية.
      ملاحظة: يجب غسل الموزع واللوحة الطرفية بالمنظف وتجفيفهما قبل الاستخدام. حشوات السيليكون قابلة لإعادة الاستخدام ويجب تخزينها في 0.5 M NaOH مع الكاسيت.
   2. قم بإعداد نظام الترشيح بالتفق التدفيقي (TFF) (المعروف أيضاً بالترشيح عبر التدفق) في وضع "مفتوح" (الشكل 3B).
      1. عند استخدام الكاسيت لأول مرة، قم بتجميع كاسيت TFF في وضع الشطف (Elution) واشطفه بـ 100 mL من الماء المعقم ذي الدرجة الجزيئية (الشكل 3C).
      2. بمجرد بقاء 5 mL فقط من الماء في خزان الاحتياطي، أوقف المضخة مؤقتاً وقم بتغيير إعداد نظام TFF إلى وضع مغلق (الشكل 3D).
      3. أضف 100 mL من 0.5 M NaOH ومبيض بتركيز 400 ppm مسخن مسبقاً إلى 42 °C إلى الخزان وقم بتدويره عبر النظام لمدة 30-60 min.
      4. أوقف التدفق وأعد نظام TFF إلى إعداد الشطف، واستأنف التدفق لشطف محلول التنظيف.
      5. عندما يتبقى حوالي 5 mL في الخزان، أوقف المضخة مؤقتاً وأضف 100 mL من الماء المعقم ذي الدرجة الجزيئية لشطف النظام.
      6. عندما يتبقى حوالي 5 mL في الخزان، أوقف المضخة مؤقتاً وضع نظام TFF في الوضع المفتوح (الشكل 3B). تابع الخطوة 2.2.3.
   3. عقم الكاسيت والأنابيب بتمرير 100 mL من 0.5 M NaOH عبر النظام باستخدام المضخة التمعجية. تأكد من أن الضغط لا يتجاوز 30 psi للحفاظ على سلامة الكاسيت.
   4. أوقف المضخة مؤقتاً عندما يتبقى حوالي 5 mL من 0.5 M NaOH في الخزان.
   5. أضف 100 mL من الماء المعقم ذي الدرجة الجزيئية إلى الخزان واستأنف تمرير السائل عبر الكاسيت. حرك الخزان بشكل دائري لغسل كل NaOH من جوانب الخزان لمنع تثبيط الفيروس. كرر خطوة غسل الخزان.
   6. عندما يتبقى حوالي 5 mL من الماء المعقم ذي الدرجة الجزيئية في الخزان، أوقف المضخة مؤقتاً.
   7. أضف 100 mL من PBS إلى الخزان، مع التحريك لضمان غسل الماء المعقم ذي الدرجة الجزيئية من الجوانب. استأنف تدفق السائل عبر الكاسيت.
   8. عندما يتبقى حوالي 5 mL في الخزان، أوقف المضخة مؤقتاً، وأضف سائل السقاء المرشح عميقاً إلى الخزان، واستأنف تدفق المضخة.
   9. راقب مقياس الضغط 1 (الشكل 3B) للتأكد من أنه لا يتجاوز 10 psi لمنع تمزق الفيروس. استخدم مزيجاً من سرعة المضخة التمعجية واستخدام ملاقط C لزيادة الشطف إلى النفايات.
      ملاحظة: سيؤدي الجمع بين سرعة المضخة التمعجية وملاقط C إلى زيادة الضغط.
   10. عندما يتبقى 50-100 mL من سائل السقاء في الخزان، أوقف المضخة مؤقتاً لإجراء تبديل للمنظم عن طريق إضافة 150-200mL من منظم ML بتركيز 1×.
   11. استأنف تدفق المضخة، مع مراقبة مقياس الضغط 1 مرة أخرى (الشكل 3B) للتأكد من أنه لا يتجاوز 10 psi.
   12. عندما يتبقى 5-10 mL في الخزان، أوقف المضخة مؤقتاً.
   13. باستخدام ملقطين من نوع C، أغلق خطي النفايات كما هو موضح في الشكل 3C.
   14. افصل خط المحتجز الذي يغذي الخزان وأدخله في أنبوب مخروطي سعة 50 mL (الشكل 3C).
   15. استأنف تدفق المضخة، وتوقف عندما يتبقى بضع قطرات من السائل في خزان الاحتياطي.
   16. أزل ملاقط C من خطوط النفايات وأعد توصيل خط تغذية المحتجز بخزان الاحتياطي (الشكل 3B).
   17. أضف 20-25 mL من منظم ML بتركيز 1× واستأنف تدفق المضخة حتى يتبقى حوالي 5 mL في خزان الاحتياطي.
   18. كرر الخطوات من 2.2.13 إلى 2.2.16.
       ملاحظة: يمكن إجراء عملية شطف ثالثة بتكرار الخطوة 2.2.17 والخطوات من 2.2.13 إلى 2.2.16 لزيادة إنتاج الفيروس. ومع ذلك، فإن معظم الفيروس يتواجد في أول عمليتي شطف.
   19. بعد الانتهاء من عمليات الشطف، ضع الفيروس على الثلج أو عند 4 °C.
   20. لتنظيف الخطوط، قم بإعداد النظام بحيث يكون في شكل حلقة مغلقة (الشكل 3D) حيث تعود خطوط النفايات إلى الخزان، كما هو موضح في الشكل 3D.
   21. باشر بتنظيف النظام بإضافة 250 mL من 0.5 M NaOH ومبيض بتركيز 400 ppm مسخن مسبقاً إلى 42 °C.
   22. مرر محلول التنظيف عبر النظام طوال الليل.
       ملاحظة: أثناء إعادة تدوير محلول التنظيف، إذا تم تشغيل المضخة بسرعة 50 mL/min، يجب ملاحظة ضغط يبلغ حوالي 5 psi. إذا تجاوز الضغط ذلك، فإن الكاسيت متسخ، ويجب استبدال محلول التنظيف وتكرار العملية.
   23. اشطف محلول التنظيف بتوجيه كلا خطي النفايات وخط المحتجز إلى وعاء نفايات.
   24. أضف 400-500 mL من الماء المعقم إلى الخزان ومرره عبر النظام وإلى أوعية النفايات.
   25. عندما يتبقى حوالي 5 mL في الخزان، أوقف المضخة مؤقتاً وأضف 100-200 mL من 0.5 M NaOH إلى خزان الاحتياطي، مع تحريك المحلول لغسل وعاء الخزان.
   26. بمجرد أن يفرغ الخزان تقريباً، كرر الخطوة 2.2.23 مرتين إضافيتين.
   27. قم بتفكيك إعداد TFF، وقم بتخزين كاسيت TFF والحشوات في حجم صغير من 0.5 M NaOH في كيس بلاستيكي قابل لإعادة الإغلاق عند 4 °C.
       ملاحظة: يمكن تخزين الأنابيب في درجة حرارة الغرفة مغمورة في 0.5 M NaOH.
3. الطرد المركزي الفائق بتدرج كثافة الإيوديكسانول
   1. قم بتشغيل جهاز الطرد المركزي الفائق واضبطه على التبريد المسبق عند 4 °C. قم بتبريد الدوار المطلوب مسبقاً عند 4 °C أيضاً (انظر جدول المواد).
      ملاحظة: يجب تخزين الدوارات عند 4 °C.
   2. استخدم محلول إيوديكسانول المركز بنسبة 60% (التركيز عند الشراء) لتحضير محاليل إيوديكسانول بتركيزات 40% و 20% و 10% عن طريق التخفيف باستخدام PBS ومنظم ML بتركيز 3× ليصل إلى تركيز نهائي 1× من منظم ML.
   3. في أنبوب طرد مركزي فائق رقيق الجدران ومفتوح القمة سعة 13.2 mL، ضع طبقات من 0.5 mL و 2.5 mL و 2.5 mL من محاليل إيوديكسانول بتركيزات 40% و 20% و 10% على التوالي (الشكل 4A).
      ملاحظة: إن إمالة أنبوب الطرد المركزي الفائق على جانبه وتفريغ المحلول ببطء سيقلل بشكل كبير من خطر اختلاط طبقتي التدرج. يجب أن يكون الفصل بين كل طبقة واضحاً، مع ظهور "هالة" مرئية بين كل طبقة من طبقات التدرج.
   4. استخدم قلماً تحديداً لتمييز الواجهات بين طبقات التدرج المختلفة.
   5. ضع طبقة من 6-6.5 mL من الفيروس المستخلص من إجراء TFF فوق تدرج الكثافة. أضف الفيروس بعناية كما هو موضح في الخطوة 2.3.3 لتجنب إزعاج تدرج الكثافة.
   6. قم بتحميل أنابيب الطرد المركزي الفائق في الحشوات المخصصة لدوار السطل المتأرجح (انظر جدول المواد) باستخدام ميزان مفتوح القمة لموازنة الحشوات في حدود 0.01 g من بعضها البعض. استخدم PBS أو كمية إضافية من مستخلص الفيروس لتعويض فروق الوزن.
   7. بمجرد موازنة الأنابيب، أغلق الأنابيب وحملها في الدوار.
   8. قم بالطرد المركزي لمدة 1.5 h عند 125,000 × g عند 4 °C.
      ملاحظة: يمكن تنفيذ ذلك طوال الليل إذا كان جهاز الطرد المركزي الفائق مزوداً بخاصية بدء التشغيل المؤجل.
   9. بعد الطرد المركزي الفائق، أخرج الأنابيب باستخدام ملقط معقم. ابحث عن النطاق المستهدف (النطاق الكبير) بين تدرجات 10% و 20% (الشكل 4B).
   10. علق الأنبوب فوق الجزء العلوي من الكأس باستخدام حامل تثبيت.
   11. قم بتوصيل إبرة 18 G × 1.5-inch بمحقنة 5 mL واثقب جانب أنبوب الطرد المركزي الفائق.
       ملاحظة: يجب ثقب الأنبوب أسفل النطاق المستهدف قليلاً، مع جعل الإبرة بزاوية صاعدة والطرف المائل للأعلى بحيث تتحرك داخل النطاق المستهدف.
   12. ادفع المكبس ببطء لإزالة النطاق المستهدف.
       ملاحظة: حرك الإبرة داخل النطاق المستهدف لزيادة كمية الفيروس المستخلص. احذر من اختلاط نطاقات أخرى أو حطام مع النطاق المستهدف، وتجنب أخذ كمية زائدة من المحلول، لأن ذلك سيؤدي إلى استخدام المزيد من كاسيتات الديلزة.
   13. بمجرد استخراج النطاق المستهدف، أزل الإبرة، واترك المحلول المتبقي يفرغ في كأس النفايات. وزع النطاق المستهدف في أنبوب مخروطي سعة 50 mL حتى يتم استخراج جميع النطاقات من جميع أنابيب الطرد المركزي الفائق الأخرى.
   14. كرر الخطوات من 2.3.10 إلى 2.3.13 حتى يتم استخراج جميع النطاقات المستهدفة من جميع أنابيب الطرد المركزي الفائق.
   15. نهج بديل لاستخراج النطاقات المستهدفة كما هو موضح في الخطوات من 2.3.10 إلى 2.3.13
       1. أزل السائل الذي يعلو النطاق المستهدف ببطء باستخدام ماصة. بمجرد الوصول إلى النطاق المستهدف، استخرجه باستخدام ماصة وخزن الفيروس في أنبوب مخروطي سعة 50 mL.
          ملاحظة: يتيح ذلك إعادة استخدام أنابيب الطرد المركزي الفائق.
4. إزالة الإيوديكسانول من محلول الفيروس
   ملاحظة: يظهر النطاق المحتوي على NDV عند كثافة إيوديكسانول تتراوح بين 15% و 16%. يمكن تحديد تركيز الإيوديكسانول في المحلول عن طريق قياس الامتصاص عند 340 nm بالرجوع إلى منحنى قياسي. يمكن إغفال هذه الخطوة حيث لم تلاحظ أي آثار سلبية أو سمية حادة عند إعطاء محاليل إيوديكسانول بهذا التركيز لفئران C57BL/6.
   1. قم بترطيب كاسيت ديلزة بحد قطع للوزن الجزيئي 10 kDa وسعة 0.5-3 mL عن طريق غمره في PBS لمدة 1 min.
      ملاحظة: يجب أن يتغير غشاء الديلزة من المظهر الأملس إلى المظهر المجعد أو المتعرج. إذا تجاوز حجم الفيروس المستخلص 10 mL، يجب استخدام كاسيتي ديلزة بسعة 0.5-3 mL أو كاسيت ديلزة واحد بسعة 5-12 mL.
   2. حسبما يقتضي الأمر، استخدم محقنة 5 أو 10 mL وإبرة تعبئة غير مدببة 18 G × 1.5 inch لجمع الفيروس من الأنبوب المخروطي سعة 50 mL.
   3. استخدم المحقنة للدخول إلى كاسيت الديلزة، مع الحرص على عدم ثقب الغشاء، ثم احقن الفيروس.
      ملاحظة: يمكن تدوير كاسيت الديلزة للتحكم في موضع الجيب الهوائي في الكاسيت. يجب إزالة الجيب الهوائي قبل إزالة الإبرة من الكاسيت.
   4. املأ كاساً سعة 1 L بـ 1× PBS معقم، وضع بداخله قضيب تحريك وكاسيت الديلزة، ثم غطّه. يتم التحضين عند 4 °C مع تحريك لطيف.
      ملاحظة: استخدم رغوة البوليسترين المبثوقة وشريطاً مطاطياً لتثبيت كاسيت الديلزة بحيث يطفو في PBS. قد ينتفخ الكاسيت قليلاً بسبب منظم ML.
   5. بعد 1-2 h، استبدله بـ 1× PBS طازج واستمر في التحضين عند 4 °C لمدة 8-10 h أخرى مع تحريك خفيف.
      ملاحظة: يمكن القيام بذلك أيضاً طوال الليل.
   6. استبدله بـ 1× PBS طازج مرة أخرى، مع التحضين في درجة حرارة الغرفة لمدة 1-2 h.
5. تركيز محلول الفيروس
   1. أخرج كاسيت الديلزة من منظم الديلزة (الشكل 4C) وضعه في كيس بلاستيكي صغير قابل للإغلاق. أضف 15-25 mL من بولي إيثيلين جليكول بتركيز 40% ووزن جزيئي 20,000 MW بحيث يكون كاسيت الديلزة مغموراً بالكامل.
   2. يتم التحضين في درجة حرارة الغرفة مع الهز. افحص حجم الفيروس في الكاسيت بشكل دوري باستخدام محقنة 5 أو 10 mL وإبرة تعبئة غير مدببة 18 G × 1.5 inch.
      ملاحظة: ستختلف المدة المطلوبة لتركيز الفيروس بناءً على الحجم الابتدائي والحجم النهائي المطلوب. عادةً ما يكون الحجم النهائي المطلوب بين 1 و 1.5 mL بغض النظر عن الحجم الابتدائي لسائل السقاء. عند فحص الحجم، احذر من استخدام نفس المنفذ، لأن ذلك سيضعف سلامة المنفذ وقد يؤدي إلى اختلاط محلول بولي إيثيلين جليكول مع الفيروس.
   3. قبل إزالة الفيروس المركز من كاسيت الديلزة، اشطف الكاسيت لفترة وجيزة في 1× PBS واملأ إبرة تعبئة غير مدببة 18 G × 1.5 inch بالهواء.
   4. أدخل المحقنة المملوءة بالهواء في كاسيت الديلزة واضغط على المكبس. قم بتدوير الجهاز بحيث يمكن إزالة الفيروس المركز دون إزالة أي من الهواء الذي تم إدخاله.
   5. وزع الفيروس المركز في أنبوب مخروطي سعة 50 mL، مع تسجيل الحجم الموزع.
   6. باستخدام نفس المحقنة والإبرة، احقن كمية مناسبة من السكروز بتركيز 60% في كاسيت الديلزة بحيث يكون التركيز النهائي للسكروز 5% عند دمجه مع الفيروس الذي تمت إزالته سابقاً.
   7. استخدم الأصابع المكسوة بالقفازات لتدليك الغشاء لإزاحة الفيروس المتبقي الذي قد يكون التصق بالغشاء، مع الحرص على عدم إتلافه. أزل بعض الهواء الزائد في كاسيت الديلزة لتسهيل عملية الإزاحة.
   8. اجمع هذا الغسول مع الفيروس الموجود بالفعل في الأنبوب المخروطي سعة 50 mL.
      ملاحظة: الفيروس الآن في سكروز بتركيز 5% وجاهز للتوزيع في حصص قدرها 20 µL أو 50 µL أو 100 µL أو 200 µL وتخزينه عند -80 °C. بدلاً من ذلك، للتخزين طويل الأمد، يمكن تجفيف NDV بالتجميد وتخزينه عند 4 °C كما هو موضح في القسم 2.6.

النتائج

الشكل 1: عدوى وحصاد فيروس NDV من بيض دجاج ملقح خالي من مسببات أمراض محددة. (A) يجب أن تظهر الأوعية الدموية الشبيهة بالشبكة (الأسهم) بعد 9 أيام من الحضن بالإضافة إلى حركة الجنين. يشير الحرف 'X' إلى الواجهة بين الغشاء الكوريون...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
حقنة Slip-Tip سعة 1 mL	BD	309659
حقنة Luer-Lok سعة 10 mL	BD	302995
محلول بوفيدون يود بتركيز 10%	LORIS	109-08
أنابيب مخروطية سعة 15 mL	Thermo-Fisher	14955240
إبرة تعبئة غير مدببة 18G × 1 1/2 in	BD	305180
إبرة Precision Glide 18G × 1 1/2 in	BD	305196
إبرة 25 G × 5/8 in	BD	305122
حقنة Luer-Lok سعة 5 mL	BD	309646
حمض الخليك، جليدي	Thermo-Fisher	A38-212
أجاروز	Froggabio	A87-500G
Alexa-Fluor 488 Goat-Anti-Mouse	Invitrogen	A11001
جهاز طرد مركزي Allegra X-14	Beckman Coulter	B08861
برسلفات الأمونيوم	BioRad	161-0700
مبيض (5%)	Thermo-Fisher	36-102-0599
ملقط عريض ذو طرف غير مسنن	Thermo-Fisher	09-753-50
بروموفينول بلو	Sigma-Aldrich	114405-25G
حامل كاسيت Centramate	PALL	CM018V
جهاز ChemiDoc XRS+	BioRad	1708265
حضانة بيض رقمية Digital 1502 Sportsman	Berry Hill	1502W
D-Mannitol	Sigma-Aldrich	M4125-500G
جهاز فحص البيض بالضوء (Candler)	Berry Hill	A46
إيثانول (70%)	Thermo-Fisher	BP82031GAL
وصلات Tee مسننة داخلية، نايلون، 1/8 in NPT(F)	Cole-Parmer	06349-50
طقم ترطيب	Berry Hill	3030
Iodixanol	Sigma-Aldrich	D1556	محلول iodixanol في الماء بتركيز 60% (w/v) (معقم)
L-Lysine Monohydrochloride	Sigma-Aldrich	62929-100G-F
وصلات Luer-Lok ذكرية وأنثوية بسن لولبي وطني 1/8 in NPT	Cole-Parmer	41507-44
محرك رقمي Masterflex L/S	Cole-Parmer	RK-07522-20	مضخة 연동ية (Peristaltic) مزودة بشاشة رقمية
رأس مضخة Masterflex L/S سهل التحميل للأنابيب الدقيقة	Cole-Parmer	RK-07514-10
أنابيب سيليكون Masterflex (Platinum) L/S 16	Cole-Parmer	96420-16	سيليكون معالج بالبلاتين BioPharm
كاسيت Omega Membrane LV Centramate، 100K	PALL	OS100T02
جهاز طرد مركزي فائق Optima XE-90	Beckman Coulter	A94471
محلول PBS بتركيز 10X	Thermo-Fisher	BP399-20
بولي (إيثيلين جليكول) متوسط Mn 20,000	Sigma-Aldrich	81300-1KG
كاسيت دياليز Slide-a-lyzer (قوة إضافية)، 10,000 MWCO 0.5-3 mL	Thermo-Fisher	66380
هيدروكسيد الصوديوم (حبيبات)	Thermo-Fisher	S318-10
بيض خالٍ من مسببات الأمراض المحددة	CFIA	NA	يختلف المورد حسب الموقع
سكروز	Thermo-Fisher	S5-3
مرشح عمق Supracap 50	PALL	SC050V100P
مقص جراحي	Thermo-Fisher	08-951-5
دوار Sw41Ti	Beckman Coulter	331362	مستخدم في خطوات البروتوكول 2.3.1، 2.3.6، 2.3.7
دوار SX4750	Beckman Coulter	369702
محول SxX4750 للأنابيب ذات القاع المخروطي	Beckman Coulter	359472
أنابيب طرد مركزي Ultraclear ذات جدار رقيق (9/16 in × 3 1/2 in)	Beckman Coulter	344059
مشبك لولبي للأنابيب	PALL	88216
مقاييس ضغط عامة	Cole-Parmer	68355-06