إعادة برمجة خلايا الدم البشرية إلى خلايا جذعية مستحثة متعددة القدرات بوساطة فيروس سينداي

الملخص

المصدر: Rim, Y. A., et al. توليد الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات من خلايا الدم باستخدام فيروس سينداي والطرد المركزي. J. Vis. Exp. (2016).

يوضح هذا الفيديو كيفية توليد الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSCs) من الخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي البشري باستخدام إعادة البرمجة بوساطة فيروس سينداي. تعمل عوامل النسخ الفيروسية على تنشيط شبكات تعدد القدرات وتثبيط جينات السلالة، مما يسمح لمجموعة فرعية من الخلايا باكتساب خصائص الالتصاق وتكوين مستعمرات من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات. يعمل البروتوكول على إثراء هذه الخلايا المعاد برمجتها والحفاظ عليها من خلال الارتباط الانتقائي بالمصفوفة والتجديد اليومي للوسط الغذائي.

البروتوكول

تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تتضمن جمع العينات وفقاً لإرشادات مجلس مراجعة المؤسسة (IRB) الخاص بالمعهد.

1. ترنسدكشن بواسطة فيروس سينداي

1. نقل الجينات (اليوم 0)
   1. اجمع خلايا الدم وانقلها إلى أنبوب مخروطي سعة 15-ml وقم بعدّها باستخدام مقياس خلايا الدم (hemocytometer).
   2. جهّز 3 x 10⁵ خلية لكل عملية نقل جينات، ثم قم بطرد الخلايا مركزياً عند 515 x g لمدة 5 min في درجة حرارة الغرفة (RT).
   3. تخلص من الطافي عن طريق الشفط، وأعد تعليق الخلايا في 0.5 ml من وسط استنبات خلايا الدم.
   4. انقل الخلايا إلى بئر في طبق غير مطلي يحتوي على 24 بئراً.
   5. أذِب خليط فيروس سينداي (Sendai virus) على الثلج وأضفه إلى الخلايا المعلقة، مع إضافة فيروس سينداي إلى الخلايا وفقاً لتوصيات الشركة المصنعة.
   6. أغلق الطبق بغشاء إحكام، ثم قم بطرده مركزياً عند 1,150 x g لمدة 30 min عند 30 °C.
   7. بعد الطرد المركزي، حضّن الخلايا عند 37 °C في 5% CO₂ طوال الليل (O/N).
2. نقل الخلايا إلى مصفوفة التغذية (اليوم 1)
   1. في اليوم التالي، اطلِ طبقاً يحتوي على 24 بئراً ببروتين الفيترونيكتين (vitronectin). خفف محلول الفيترونيكتين في PBS ليصل التركيز النهائي إلى 5 µg/ml. أضف 1 ml من الفيترونيكتين إلى بئر في طبق الـ 24 بئراً وحضّنه في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة ساعة واحدة على الأقل. أزل محلول الطلاء قبل الاستخدام. يمكن تخزين الأطباق المطلية في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 3 أيام.
   2. انقل جميع الأوساط التي تحتوي على الخلايا والفيروس إلى البئر المطلي.
   3. اجمع الخلايا المتبقية باستخدام 0.5 ml إضافية من وسط استنبات خلايا دم طازج وأضفها إلى البئر الذي يحتوي على الخلايا.
   4. قم بطرد الطبق مركزياً عند 1,150 x g لمدة 10 min عند 35 °C.
   5. بعد الطرد المركزي، أزل الطافي، وأضف 1 ml من وسط iPSC، وحافظ على الخلايا عند 37 °C في 5% CO₂ طوال الليل (O/N).
3. النقل الثاني للخلايا (اليوم 2)
   1. اطلِ آبار طبق جديد يحتوي على 24 بئراً بتركيز 5 µg/ml من الفيترونيكتين، كما هو موضح في الخطوة 1.2.1. استخدم بئراً واحداً من الطبق لكل عملية نقل جينات.
   2. انقل معلق الخلايا من الطبق الأول إلى طبق الفيترونيكتين المطلي حديثاً.
      ملاحظة: يمكن التخلص من الخلايا المعلقة إذا لم تكن هناك حاجة إليها. يمكن تكرار الإجراء المذكور في الخطوة 2.3 من 2-3 مرات مع الخلايا المعلقة. وفي حال تكرار الخطوات، قم بحصد الخلايا.
   3. في هذه الأثناء، أضف 1 ml من وسط iPSC (الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات) إلى بئر الطبق الأول لأغراض الصيانة، وحضّنه عند 37 °C في 5% CO₂ طوال الليل (O/N).
   4. حافظ على الخلايا الملتصقة عند 37 °C و 5% CO₂، وقم بتغيير الوسط يومياً بوسط iPSC طازج. ستظهر المستعمرات في الأيام من 14 إلى 21 بعد عملية نقل الجينات.
   5. قم بطرد الطبق المطلي حديثاً والذي يحتوي على الخلايا المعلقة مركزياً عند 1,150 x g و 35 °C لمدة 10 min.
   6. بعد الطرد المركزي، حضّن الخلايا عند 37 °C في 5% CO₂ طوال الليل (O/N).
   7. في اليوم التالي، أزل الطافي واستبدله بوسط iPSC طازج.
      ملاحظة: يمكن تكرار الإجراء المذكور في الخطوة 1.3 من 2-3 مرات مع الخلايا المعلقة. وفي حال تكرار الخطوات، احصد الخلايا الموجودة في الطافي وكرر الخطوة 1.3.
   8. حافظ على الخلايا الملتصقة من خلال تغيير الوسط يومياً حتى يتم الوصول إلى درجة تلاقي (confluency) بنسبة 80%.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
الأدوات البلاستيكية المختبرية
أنبوبة مخروطية سعة 50 مل	طحال (SPL)	50050
أنبوب مخروطي سعة 15 مل	طحال	50015
ماصة بلاستيكية تستخدم لمرة واحدة سعة 10 مل	فالكون	7551
ماصة بلاستيكية تستخدم لمرة واحدة سعة 5 مل	فالكون (Falcon)	7543
طبق بـ 12 بئراً	TPP	92012
طبق 24 بئراً	التحول الجيني باستخدام فيروس Sendai التحول الجيني (اليوم 0) تُجمع الخلايا الدموية وتُنقل إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل، ثم تُعد باستخدام مقياس كرات الدم (hemocytometer). تُحضّر كمية 3 × 10^5 خلية لكل عملية تحول جيني، وتُفصل الخلايا بجهاز الطرد المركزي عند 515 × g لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT). يُتخلص من السائل العلوي عن طريق الشفط، وتُعلق الخلايا مجددًا في 0.5 مل من وسط زراعة الخلايا الدموية. تُنقل الخلايا إلى فجوة في طبق 24 فجوة غير مطلي. يُذاب خليط فيروس Sendai على الثلج ويُضاف إلى الخلايا المعلقة، على أن تُضاف كمية الفيروس وفقًا لتوصيات الشركة المصنعة. يُغلق الطبق بغشاء إغلاق، ويُفصل بجهاز الطرد المركزي عند 1,150 × g لمدة 30 دقيقة عند درجة حرارة 30 مئوية. بعد الطرد المركزي، تُحضن الخلايا عند 37 درجة مئوية في بيئة تحتوي على 5% من ثاني أكسيد الكربون (CO2) طوال الليل (O/N). نقل الخلايا إلى مصفوفة التغذية (اليوم 1) في اليوم التالي، يُطلى طبق 24 فجوة ببروتين الفيترونيكتين (vitronectin). يُخفف محلول الفيترونيكتين في محلول PBS للوصول إلى تركيز نهائي قدره 5 ميكروغرام/مل. يُضاف 1 مل من الفيترونيكتين إلى فجوة في الطبق ويُحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة على الأقل. يُزال محلول الطلاء قبل الاستخدام، ويمكن تخزين الأطباق المطلية في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 أيام. يُنقل كامل الوسط الذي يحتوي على الخلايا والفيروس إلى الفجوة المطلية. تُجمع الخلايا المتبقية باستخدام 0.5 مل إضافية من وسط زراعة الخلايا الدموية الطازج وتُضاف إلى الفجوة التي تحتوي على الخلايا. يُفصل الطبق بجهاز الطرد المركزي عند 1,150 × g لمدة 10 دقائق عند 35 درجة مئوية. بعد الطرد المركزي، يُزال السائل العلوي، ويُضاف 1 مل من وسط زراعة الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSC)، وتُحفظ الخلايا عند 37 درجة مئوية في بيئة تحتوي على 5% من ثاني أكسيد الكربون طوال الليل. النقل الثاني للخلايا (اليوم 2) تُطلى فجوات طبق 24 فجوة جديد ببروتين الفيترونيكتين بتركيز 5 ميكروغرام/مل، كما هو موضح في الخطوة 1.2.1، مع استخدام فجوة واحدة من الطبق لكل عملية تحول جيني. يُنقل معلق الخلايا من الطبق الأول إلى طبق الفيترونيكتين المطلي حديثًا. ملاحظة: يمكن التخلص من الخلايا المعلقة في حال عدم الحاجة إليها. كما يمكن تكرار الإجراء المذكور في الخطوة 2.3 من 2 إلى 3 مرات مع الخلايا المعلقة، وفي حال تكرار الخطوات، يتم حصاد الخلايا. وفي الوقت ذاته، يُضاف 1 مل من وسط زراعة الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSC) إلى فجوة الطبق الأول لأغراض الصيانة، وتُحضن عند 37 درجة مئوية في بيئة تحتوي على 5% من ثاني أكسيد الكربون طوال الليل. تُحفظ الخلايا الملتصقة عند 37 درجة مئوية و5% من ثاني أكسيد الكربون، مع تغيير الوسط يوميًا بوسط iPSC طازج. ستظهر المستعمرات في الأيام من 14 إلى 21 بعد عملية التحول الجيني. يُفصل الطبق المطلي حديثًا والذي يحتوي على الخلايا المعلقة بجهاز الطرد المركزي عند 1,150 × g و35 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. بعد الطرد المركزي، تُحضن الخلايا عند 37 درجة مئوية في بيئة تحتوي على 5% من ثاني أكسيد الكربون طوال الليل. في اليوم التالي، يُزال السائل العلوي ويُستبدل بوسط iPSC طازج. ملاحظة: يمكن تكرار الإجراء المذكور في الخطوة 1.3 من 2 إلى 3 مرات مع الخلايا المعلقة. وفي حال تكرار الخطوات، يتم حصاد الخلايا الموجودة في السائل العلوي وتكرار الخطوة 1.3. تُحفظ الخلايا الملتصقة مع تغيير الوسط يوميًا حتى الوصول إلى نسبة تلاقي (confluency) تبلغ 80%.	92024
مواد توليد وزراعة الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSC)
طقم إعادة برمجة Sendai للخلايا الجذعية المحفزة متعددة القدرات CytoTune-iPSC	Life Technologies	A16518
وسط TeSR-E8 الغذائي	STEMCELL Technologies	5940	وسط نمو الخلايا الجذعية المحفزة وافرة القدرة (iPSC media)
فيترونيكتين	Life Technologies	A14700
TrypLE express (TrypLE)	Life Technologies	12604-039
ReleSR	STEMCELL Technologies	12604-039	محلول فصل المستعمرات