تحليل استدخال فيروس الإنفلونزا باستخدام مقايسة حجب الستريبتاديفين

الملخص

المصدر: بوهل، م. أو. وستيرتز، س. قياس التصاق واندماج فيروس الإنفلونزا أ في خلايا A549 باستخدام قياس التدفق الخلوي. J. Vis. Exp. (2015)

يوضح هذا الفيديو استخدام مقايسة حجب الستريبتفيدين للتمييز بين فيروس الإنفلونزا المرتبط بالسطح والفيروس الذي تم استيعابه داخلياً في الخلايا الظهارية للرئة البشرية. وتظهر مقارنة إشارات الفلورة أن الشدة الأعلى بعد الحضن تشير إلى نجاح الاستيعاب الداخلي للفيروس.

البروتوكول

1. مقايسة الالتصاق/الاستيعاب الداخلي

ملاحظة: تأكد من تحضير جميع الكواشف قبل البدء في المقايسة. بالنسبة لمجموعات الضبط الثلاث المعروضة في قسم النتائج (الخلايا غير المصابة، والخلايا المعالجة مسبقاً بإنزيم neuraminidase، والخلايا المعالجة بـ sodium azide)، فإن الأمر يتطلب إجراء تعديلات طفيفة على البروتوكول.

1. جهّز 16 أنبوباً عميقاً يحتوي كل منها على 200,000 خلية A549. وإلى جانب المجموعة التجريبية المكونة من 4 أنابيب، توجد 3 ظروف ضابطة، تتطلب كل منها 4 أنابيب: خلايا غير مصابة (mock-infected)، وخلايا مُعالجة مسبقاً بالنيورامينيداز (NA)، وخلايا مُعالجة بأزيد الصوديوم. تتكون كل مجموعة من 4 أنابيب مُسمى بـ "0 دقيقة"، و"0 دقيقة + ستريبتأفيدين (STV)"، و"30 دقيقة"، و"30 دقيقة + STV".
2. قم بطرد الأنابيب مركزياً عند 4 °C لمدة 3 دقائق عند 450 x g. أزل السائل الطافي وأعد تعليق الراسب في 200 µl من المحلول الملحي الملحق بالفوسفات (PBS).
3. قم بطرد الأنابيب مركزياً عند 4 °C عند 450 x g. أزل السائل الطافي وأعد تعليق الراسب في 200 µl من وسط Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) الذي يحتوي على 0.3% ألبومين المصل البقري (BSA)، و20 mM من حمض 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)، و1% بنسيلين-ستريبتوميسين (وسط الحضن). احضن الخلايا لمدة 30 دقيقة عند 37 °C.
   ملاحظة: بالنسبة لعينة الضبط بالنيورامينيداز: استخدم نيورامينيداز بكتيري (مثل sialidase من Vibrio cholera) بتركيز 200 mU/ml مُخفف في وسط الحضن لإعادة تعليق الخلايا.
4. قم بطرد الأنابيب مركزياً عند 4 °C لمدة 3 دقائق عند 450 x g. أزل السائل الطافي وأعد تعليق الراسب في 200 µl من PBS. كرر هذه الخطوة مرة أخرى، ثم برد الأنابيب على الثلج لمدة 10 دقائق.
5. قم بطرد الأنابيب مركزياً عند 4 °C لمدة 3 دقائق عند 450 x g. أزل السائل الطافي وأعد تعليق الراسب في 100 µl من الفيروس المبيوتني (استخدم تركيز الفيروس المحدد في القسم 2 مُخففاً في PBS الخاص بالعدوى). احضن العينات لمدة ساعة واحدة على الثلج.
6. قم بطرد الأنابيب مركزياً عند 4 °C لمدة 3 دقائق عند 450 x g. أزل السائل الطافي وأعد تعليق الراسب في 200 µl من PBS. كرر هذه الخطوة مرة أخرى.
   ملاحظة: بالنسبة لعينة الضبط غير المصابة: استخدم PBS الخاص بالعدوى بدون فيروس. بالنسبة لعينة الضبط بأزيد الصوديوم: استخدم الفيروس مُخففاً في PBS الخاص بالعدوى المضاف إليه 0.1 % أزيد الصوديوم.
7. معالجة العينات بعد العدوى على الثلج:
   1. بالنسبة لعينات "0 دقيقة"، اتبع الخطوة 2.5 وخزن العينات عند 4 °C حتى يتم تثبيت العينات الأخرى.
   2. بالنسبة لعينات "0 دقيقة + STV"، قم بطرد الأنابيب مركزياً عند 4 °C لمدة 3 دقائق عند 450 x g. أزل السائل الطافي وأعد تعليق الرواسب في 50 µl من STV (استخدم التركيز المحدد في القسم 3) مُخففاً في PBS يحتوي على 2% BSA و0.1% أزيد الصوديوم (لمنع الاندماج الداخلي أثناء معالجة العينة). احضنها لمدة 30 دقيقة على الثلج.
   3. قم بطرد الأنابيب مركزياً عند 4 °C لمدة 3 دقائق عند 450 x g. أزل السائل الطافي وأعد تعليق الراسب في 200 µl من PBS. كرر هذه الخطوة مرة أخرى.
   4. للتثبيت، قم بطرد الأنابيب مركزياً عند 4 °C لمدة 3 دقائق عند 450 x g. أزل السائل الطافي وأعد تعليق الراسب في 100 µl من بارافورمالدهيد (PFA) بتركيز 3.7%. احضنها لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT). ثم كرر خطوة الغسل الموضحة في 1.6) وخزن العينات عند 4 °C.
   5. بالنسبة لعينات "30 دقيقة"، قم بطرد الأنابيب مركزياً عند 4 °C لمدة 3 دقائق عند 450 x g. أزل السائل الطافي وأعد تعليق الراسب في 200 µl من PBS يحتوي على 2% BSA. احضنها لمدة 30 دقيقة عند 37 °C. اتبع الخطوات 1.7.3-1.7.4 وخزن العينات عند 4 °C.
      ملاحظة: بالنسبة لعينة الضبط بأزيد الصوديوم: استخدم PBS مُضافاً إليه 2 % BSA و0.1 % أزيد الصوديوم لعملية الحضن لمدة 30 دقيقة عند 37 °C.
   6. بالنسبة لعينات "30 دقيقة + STV"، قم بطرد الأنابيب مركزياً عند 4 °C لمدة 3 دقائق عند 450 x g. أزل السائل الطافي وأعد تعليق الراسب في 200 µl من PBS يحتوي على 2% BSA. احضنها لمدة 30 دقيقة عند 37 °C. ثم قم بطرد الأنابيب مركزياً عند 4 °C لمدة 3 دقائق عند 450 x g. أزل السائل الطافي وأعد تعليق الرواسب في 50 µl من STV (استخدم التركيز المحدد في القسم 3) مُخففاً في PBS يحتوي على 2% BSA و0.1% أزيد الصوديوم (لمنع الاندماج الداخلي أثناء معالجة العينة). احضنها لمدة 30 دقيقة على الثلج. اتبع الخطوات 1.7.3-1.7.4 وخزن العينات عند 4 °C.
      ملاحظة: بالنسبة لعينة الضبط بأزيد الصوديوم: استخدم PBS مُضافاً إليه 2 % BSA و0.1 % أزيد الصوديوم لعملية الحضن لمدة 30 دقيقة عند 37 °C.
8. لنفاذية الخلايا، قم بطرد الأنابيب مركزياً عند 4 °C لمدة 3 دقائق عند 450 x g. أزل السائل الطافي وأعد تعليق الراسب في 100 µl من PBS يحتوي على 0.5% Triton X-100. احضنها لمدة 6 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT). ثم كرر خطوة الغسل الموضحة في 1.6).
9. قم بطرد الأنابيب مركزياً عند 4 °C لمدة 3 دقائق عند 450 x g. أزل السائل الطافي وأعد تعليق الراسب في 50 µl من 2% BSA مُخفف في PBS يحتوي على STV-Cy3. (يرجى ملاحظة وجوب تحديد التركيز المناسب لـ STV-Cy3 قبل بدء التجربة. ابدأ بتركيز 1:200 واختبر تخفيفات بمضاعفات اثنين حتى تصل إلى 1:2,400. في تجاربنا، ثبت أن تخفيف 1:1,000 هو الأمثل).
10. احضن العينات لمدة ساعة واحدة في الظلام في درجة حرارة الغرفة (RT). ثم كرر خطوة الغسل الموضحة في 1.6 ولكن أعد تعليق الراسب في 200 µl من 2% BSA مُخفف في PBS.
11. حلل العينات بواسطة قياس التدفق الخلوي (flow cytometry). حدد النسبة المئوية للخلايا الموجبة لـ Cy3 في كل عينة.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
DMEM	Life Technologies	41966-052
FBS	Life Technologies	10270-106
البنسلين-ستريبتومايسين	Life Technologies	15140-163
PBS	Life Technologies	14190-169
BSA	VWR Calbiochem	126579
HEPES	Life Technologies	15630-100
D-Sucrose	Fluka	84100
Bio Rad Protein Bio Assay	Bio Rad	500-0006
أنابيب عميقة (أنابيب دقيقة 1.2 ml)	Milian	82 00 001
PFA	Lucerna chem Electron microscopy sciences	15710
أنابيب طرد مركزي فائق	Hemotec HmbH	253070
Triton X-100	Fluka	93420
STV-Cy3	Life Technologies	43-4315
STV	Life Technologies	43-4302
أزيد الصوديوم	Fluka	71290
نيورامينيداز/سياليداز بكتيرية	Sigma-Aldrich	N6514-1UN