تقييم تثبيط النمو البكتيري بوساطة العاثيات باستخدام قياسات الكثافة الضوئية

الملخص

المصدر: Niu, Y. D., وآخرون. تقييم فعالية العاثيات (البكتيريوفاج) في المكافحة الحيوية لمسببات الأمراض المنقولة بالغذاء عبر إعدادات عالية الإنتاجية. J. Vis. Exp. (2021)

يوضح هذا الفيديو مقايسة تعتمد على الأطباق الدقيقة لتقييم النشاط التحليلي لخليط من العاثيات ضد مستنبتات بكتيرية من E.coli. كما يسلط الضوء على كيفية كشف التغيرات في الكثافة الضوئية عن فاعلية العاثيات والتركيز اللازم للتثبيط البكتيري الكامل

البروتوكول

1. تحضير المحلول المنظم والكواشف

1. قم بتحضير 500 mL من مرق صويا تريبتيك (TSB) (15 g من مسحوق TSB و 500 mL من الماء فائق النقاء) وعقمه باستخدام الموصدة (autoclave).
   ملاحظة: يمكن تخزين هذا المرق في درجة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى 3 أشهر أو في درجة حرارة 4 °C لمدة تصل إلى 6 أشهر.
2. قم بتحضير 500 mL من آجار صويا تريبتيك (TSA) (20 g من مسحوق TSA و 500 mL من الماء فائق النقاء) وعقمه باستخدام الموصدة.
   ملاحظة: يمكن تخزين هذا الآجار في درجة حرارة 4 °C لمدة تصل إلى 3 أشهر.
3. قم بتحضير 500 mL من المحلول الملحي المنظم بالفوسفات (PBS؛ 4 g من NaCl، و 0.1 g من KCl، و 0.77 g من Na₂HPO₄، و 0.12 g من KH₂PO₄، و 500 mL من الماء فائق النقاء)، ثم قم بقياس وضبط قيمة pH لتكون 7.2 ± 0.2 عند درجة حرارة 25 °C وعقمه باستخدام الموصدة.
   ملاحظة: يمكن تخزين هذا المحلول في درجة حرارة 4 °C لمدة تصل إلى 6 أشهر.
4. قم بتحضير 200 mL من MgSO₄ بتركيز 1 M (49.294 g و 200 mL من الماء فائق النقاء) وعقمه باستخدام مرشح بولي إيثر سلفون بمقاس 0.22 µm.
5. قم بتحضير 500 mL من مرق TSB مع 10 mM من MgSO₄ (mTSB؛ 15 g من مسحوق TSB، و 500 mL من الماء فائق النقاء، و 5 mL من MgSO₄ بتركيز 1 M) وعقمه باستخدام الموصدة؛ ثم اترك الوسط المعقم ليبرد حتى يصل إلى درجة حرارة الغرفة. اتبع تقنية التعقيم. وباستخدام ماصة سيرولوجية، انقل بعناية 5.0 mL من MgSO₄ بتركيز 1 M؛ ثم حرك المزيج بلطف بالتدوير.

2. تحضير المزرعة البكتيرية

1. لتحضير مزرعة مختبر الأبحاث البكتيرية (BRLC)، أخرج قارورة (أو قوارير) المخزون من الجلسرول من مجمّد المخزون وانقلها إلى المختبر.
2. باستخدام حلقة تلقيح مخصصة للاستخدام مرة واحدة أو ما يعادلها، اغمس الحلقة في القارورة، وخذ كمية من اللقاح (المادة المتجمدة شبه السائلة)، وقم بتخطيطها على طبق TSA أو ما يعادله داخل كابينة سلامة بيولوجية من المستوى الثاني. حضّن الطبق عند 37 ± 2 °C لمدة 15-18 ساعة.
3. ضع أطباق BRLC المُحضرة في أكياس واحفظها عند 4 °C.
   ملاحظة: فترة الصلاحية العامة لـ BRLC هي 14 يوماً عند 4 °C بعد التحضير.
4. لقّح مستعمرة واحدة من كل سلالة E. coli O157 من أطباق BRLC المراد اختبارها في 10 mL من TSB، وحضنها سكونياً عند 37 °C لمدة 18 ساعة للوصول إلى 9 log10 CFU/mL.
5. قم بإجراء تخفيف تسلسلي للمزارع التي حُضنت طوال الليل (في صباح اليوم التالي)، لكل سلالة من E. coli O157 باستخدام mTSB يحتوي على 10 mM من MgSO₄ لتحقيق تركيز 4-5 log10 CFU/ml (أو أي مستوى لقاح آخر مطلوب).
6. امزج حجماً متساوياً من المزارع التي حُضنت طوال الليل لكل سلالة لتحقيق تركيز إجمالي يتراوح بين 4-5 log10 CFU/mL (أو حسب الرغبة) لتحضير الخليط البكتيري.
7. ضع المزرعة البكتيرية المخففة فوراً عند 4 °C حتى يحين وقت استخدامها.
8. خفف مزرعة اللقاح بمقدار 10 أو 100 ضعف، وازرع أجزاء بحجم 0.1 mL من هذه التخفيفات على أطباق TSA للحصول على مستعمرات معزولة.

3. تحضير محاليل العمل الخاصة بالبكتيريوفاج

1. قم بإكثار مخزونات العمل ذات العيار العالي لكل عاثية سيتم فحصها (≥108 PFU/mL) باتباع الطرق القياسية4.
   ملاحظة: مدة الصلاحية العامة لمخزونات العاثيات هي 3 أشهر في زجاجة بلاستيكية عند 4 °C بعد التحضير.
2. للوصول إلى العيار المطلوب، على سبيل المثال ~10⁸ PFU/mL لحركية التحلل، قم بتخفيف تحضيرات العاثيات الفردية باستخدام mTSB المحتوي على 10 mM من MgSO₄. قم بتحضير كوكتيلات العاثيات عن طريق خلط أحجام متساوية من كل مخزون عمل له العيار نفسه بجميع التجميعات الممكنة.

4. تحضير حركية التحلل في المختبر (in-vitro) لكل عاثية على حدة ولخلطات العاثيات

1. قم بإعداد تخفيفات متسلسلة بمعدل 10 أضعاف لكل عاثية في الأعمدة 1-8 في أطباق ميكروية معقمة ذات 96 بئراً لتجهيز مقايسة الطبق الميكروي.
   ملاحظة: يمكن اختبار أربع عاثيات ضد سلالة بكتيرية واحدة في مكررات، في أعمدة متجاورة، في كل طبق. أما الأعمدة الأربعة المتبقية فهي مخصصة لعناصر التحكم، والتي تكون خالية من العاثيات، بالإضافة إلى عينة mTSB الفارغة (الشكل 1).
2. ضع 180 µL من mTSB في الآبار من العمود 1 إلى 12 في الطبق الميكروي ذي 96 بئراً.
3. أضف 20 µL من العاثيات الفردية المخففة أو كوكتيلات العاثيات (~108 PFU/mL) إلى الآبار 1-8 في الصف العلوي من الطبق الميكروي (الصف A).
4. بالنسبة لعنصر التحكم الخالي من العاثيات والعينة الفارغة، أضف 20 µL من mTSB إلى البئر العلوي في الأعمدة 9 و 10 و 11.
5. باستخدام ماصة 12 قناة، قم بتخفيف المحتويات في الطبق. انقل 20 µL من صف إلى آخر. اخلط المحتويات جيداً عن طريق السحب والطرد المتكرر واللطيف (خمس مرات على الأقل)، مع تغيير الرؤوس بين التخفيفات. قم بإزالة 20 µL من الصف الأخير (الصف H).
   ملاحظة: يوصى باستخدام رؤوس مزودة بمرشحات لمنع التلوث الخلطي.
6. جهز خزاناً لكل سلالة. استخدم ماصة 1 mL لنقل 2-3 mL من المزرعة المخففة إلى الخزان. بالنسبة للأعمدة 1-10، استخدم ماصة متعددة القنوات لإضافة 20 µL من المزرعة البكتيرية المخففة إلى كل بئر. قم بتغيير الرؤوس بين كل عملية إضافة.
7. غطِّ الطبق الميكروي واحضه في الظروف المطلوبة (على سبيل المثال، 37 °C لمدة 10 h أو 22 °C لمدة 22 h).
8. عند مرور 2 h أو فترات زمنية أخرى مطلوبة، أخرج الأطباق الميكروية من الحاضنة.

النتائج

الشكل 1: المخطط المقترح لمقايسة الصفيحة الدقيقة ذات الـ 96 بئراً. يتم تحضير تخفيفات تسلسلية بمقدار 10 أضعاف لكل عاثية في الأعمدة 1-8 من الصفائح الدقيقة المعقمة ذات الـ 96 بئراً. يمكن اختبار أربعة أنواع من العاثيات ضد سلالة بكتيرية واحدة في مكررات، في أعمدة متجاورة، في كل صفيحة. أما الأعمدة المتبقية فهي مخصصة للعينات الضابطة.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
المستلزمات والكواشف والمعدات الأساسية
كبريتات المغنيسيوم سباعية الهيدرات	Sigma	1374361
Pipet-Lite LTS Pipette L-1000XLS+	METTLER TOLEDO	17014382
Pipet-Lite LTS Pipette L-300XLS+	METTLER TOLEDO	17014405
Pipet-Lite Multi Pipette L12-20XLS+	METTLER TOLEDO	17013808
Pipet-Lite Pipette, Unv. SL-20XLS+	METTLER TOLEDO	17014412
Pipette Tips RT LTS 1000µL FL 768A/8-low retention	METTLER TOLEDO	30389213
Pipette Tips SR LTS 20µL F 960A/5	METTLER TOLEDO	17005860
خزان سوائل	METTLER TOLEDO	89094-662
ألواح ميكروية من البوليسترين معقمة وشفافة ذات قاع مسطح وبـ 96 بئر مع أغطية	Fisher	168055
آجار تريبتيك صويا (TSA)	Sigma	105458-0500
مرق تريبتيك صويا (TSB)	Sigma	105459-0500
ناشرات خلايا على شكل حرف T	VWR	76299-566
الأجهزة
حضانات ميكروبيولوجية مدمجة	Fisher	50125590H
قضبان تحريك مضلعة	FIsher	14-512-125	الطول: 20 mm
Synergy Neo2 Hybrid Multi-Mode Reader	Fisher	BTNEO2M
البرمجيات
SAS	SAS Institute	9.4