توسيم جينومات فيروس HSV-1 المتضاعفة باستخدام نظير نوكليوزيدي

الملخص

المصدر: ديمبوفسكي، ج. أ.، ديلوكا، ن. أ. تنقية الحمض النووي الفيروسي لتحديد البروتينات الفيروسية والخلوية المرتبطة به. مجلة التجارب المرئية (2017)

يوضح هذا الفيديو عملية إصابة خلايا ثديية في طور السكون بفيروس HSV-1 (الفيروس القهري البسيط-1)، يليها تضاعف الجينوم الفيروسي باستخدام آليات التضاعف الخاصة بالعائل والفيروس. يتم دمج نظير نوكليوزيد اصطناعي في الحمض النووي الفيروسي المُصنع حديثًا لوسم الجينومات المتضاعفة، والتي يتم عزلها لاحقًا لإجراء تحليل بروتومي للبروتينات الفيروسية وبروتينات العائل المرتبطة بها.

البروتوكول

1. زراعة الخلايا، والعدوى الفيروسية، والوسم بـ EdC (5-Ethynyl-2′-deoxycytidine) (الشكل 1)

يتضمن البروتوكول التالي العمل مع الفيروسات. يرجى الرجوع إلى بروتوكولات السلامة البيولوجية الخاصة بمؤسستك فيما يتعلق بالتداول الآمن للفيروسات والعوامل البيولوجية الأخرى. تمت الموافقة على هذا البروتوكول من قبل مجلس المراجعة المؤسسية بجامعة بيتسبرغ.

1. قم بمعالجة خلايا MRC-5 (سلالة خلايا مجلس البحوث الطبية 5) في قارورة زراعة أنسجة بحجم 150 cm² وصلت لمرحلة الالتحام باستخدام التريبسين، ثم انقل الخلايا إلى طبق زراعة أنسجة بحجم 600 cm2 يحتوي على 100 mL من وسط DMEM (وسط إيجل المعدل من دولبيكو) مضافاً إليه 10% FBS. حضّن الخلايا عند 37 °C في وجود 5% CO₂ لمدة 3 - 4 أيام حتى تصل إلى مرحلة الالتحام والطور الساكن. يحتوي الطبق الملتحم بحجم 600 cm2 على حوالي 7 x 10⁷ خلية. جهّز طبقاً واحداً لكل حالة تجريبية وطبقاً واحداً لكل ضابط سلبي مقابل.
   ملاحظة: يجب أن تصل الخلايا إلى الطور الساكن لتثبيط تضاعف الحمض النووي الخلوي، وذلك لضمان وسم وتنقية vDNA (الحمض النووي الفيروسي) فقط في الخطوات اللاحقة.
   ملاحظة: تتطلب كل عينة ضابطاً سلبياً مكملاً غير موسوم يتم تحضيره باستخدام نفس ظروف الإصابة والنقطة الزمنية دون إضافة EdC.
   ملاحظة: ينبغي إجراء نسخة مصغرة من هذه التجربة بالتوازي لاختبار وسم الحمض النووي الخلوي عن طريق التصوير، باستخدام ظروف نمو خلوي وإصابة ووسم بـ EdC ونقاط زمنية مماثلة (راجع الخطوة 2).
2. خفف 7 x 10⁸ PFU (وحدات تشكيل اللويحات) من HSV-1 في 7 mL من محلول TBS (المحلول الملحي المنظم بالتريس) البارد. قم بإزالة وسط النمو واحفظه عند 37 °C. ولإجراء الإصابة، أضف الفيروس المخفف (7 mL) إلى خلايا MRC-5 مع الرج لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. بعد عملية الامتزاز، قم بإزالة اللقاح، واشطف الخلايا بـ 50 mL من محلول TBS في درجة حرارة الغرفة، ثم أعد وسط النمو الأصلي. حضّن الخلايا عند 37 °C في وجود 5% CO₂. يجب تنفيذ هذه الخطوة لكل حالة تجريبية ولكل ضابط سلبي.
   ملاحظة: يمكن تحقيق زيادة في وسم EdC باستخدام طفرات HSV-1 التي تعاني من خلل في تعبير dUTPase الفيروسي (جين UL50) و/أو uracil glycosylase (جين UL2). يتميز dUTPase الخاص بـ HSV-1 بخصوصية منخفضة للركيزة ويمكن أن يقلل من تنشيط العديد من نظائر النوكليوزيد.
3. قم بوسم الجينومات الفيروسية باستخدام EdC. اتبع الإرشادات لوسم الجينومات الداخلة (1.3.1.)، أو الجينومات المتضاعفة (1.3.2.)، أو شوك التضاعف الفيروسي (1.3.3.).
   ملاحظة: يجب تنفيذ الخطوة 1.3.1 أو 1.3.2 أو 1.3.3 فقط، اعتماداً على ما إذا كان سيتم تحليل الجينومات الداخلة، أو الجينومات المتضاعفة، أو شوك التضاعف في الخطوات اللاحقة، على التوالي.
   ملاحظة: يمكن استبدال EdC بـ EdU أو f-ara EdU. يجب مراقبة سمية نظائر النوكليوزيد وتقليلها إلى أدنى حد.
   1. استخدم المخزونات الموسومة مسبقاً لإجراء الإصابة في الخطوة 1.2، ثم انتقل إلى الخطوة 2 أو 3 خلال 4 ساعات بعد الإصابة (hpi) لفحص vDNA غير المتضاعف (الشكل 1A).
      ملاحظة: قم بتحضير مخزونات الفيروس الموسومة مسبقاً باستخدام البروتوكول الموصوف سابقاً25. يجب تمرير مخزونات الفيروس عبر عمود G-25 لإزالة أي بقايا من EdC.
   2. قم بوسم vDNA المتضاعف بإضافة 5 - 25 µM من EdC إلى وسط زراعة الخلايا المصابة لمدة 2 - 4 ساعات (الشكل 1B). قبل الإضافة، خفف EdC في 1 mL من وسط النمو.
   3. لوسم شوك التضاعف الفيروسي، بعد بدء تضاعف vDNA (≥4 hpi)، قم بـ "الوسم النبضي" (pulse label) لـ vDNA المتضاعف باستخدام 5 - 25 µM من EdC لمدة 5-20 دقيقة. ولإجراء عملية "المطاردة" (chase)، اشطف الخلايا 3 مرات بوسط المطاردة الذي يحتوي على 25 - 100 µM من 2´deoxycytidine (deoxyC)، ثم حضّن الخلايا في وجود وسط المطاردة لمدة إضافية تتراوح بين 20-40 دقيقة (الشكل 1C).
      ملاحظة: يجب موازنة وسط النبض والمطاردة عند 37 °C و 5% CO₂ قبل الاستخدام.
      ملاحظة: في تجارب النبض والمطاردة، من المهم مراعاة الوقت الذي تستغرقه النوكليوزيدات للدخول إلى الخلية وفسفرتها قبل أن يتم دمجها في الحمض النووي المتضاعف؛ ويجب تحديد ذلك تجريبياً.
      ملاحظة: لتحديد دقة تجارب النبض والمطاردة، احسب معدل التضاعف الفيروسي في ظل الظروف التجريبية المستخدمة. يمكن تحديد ذلك عن طريق PCR الكمي للجينومات الفيروسية خلال مسار زمني للنمو في خطوة واحدة.

النتائج

الشكل 1: طرق وسم DNA لفيروس HSV-1. (A) لتقييم حالة الفيروس الداخل، تُعدى خلايا MRC-5 الساكنة في طور G0 بفيروس HSV-1 موسوم مسبقاً، وتُقيم الجينومات في غضون أقل من 4 hpi لدراسة DNA الفيروسي غير المتضاعف. (B) لتقييم حالة الفيروس المتضاعف، تُعدى خلايا MRC-5 بفيروس HSV-1 غير موسوم، ويُضاف EdC (النجوم البرتقالية) إلى وسط نمو الخلايا المصابة وتُحضن لمدة 2 - 4 h بعد بدء تضاعف DNA الفيروسي (≥4 hpi). (C) لتقييم شوكات التضاعف الفيروسي، تُوسم الخلايا المصابة بنبضة من EdC لمدة 5-20 min. بعد ذلك، يمكن تتبع شوكات التضاعف باستخدام deoxyC. يظهر DNA الموسوم بـ EdC باللون البرتقالي. تم تعديل هذا الشكل عن Dembowski و DeLuca

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
خلايا MRC-5	ATCC	CCL-171
مصل جنين البقر (FBS)	Gibco	26140-179
وسط ديولبيكو المعدل (DMEM)	Gibco	12800-082	مُضاف إليه 10% FBS، و2 mM L-glutamine، و12 mM (للنمو في الدوارق) أو 30 mM (للنمو في الأطباق) من بيكربونات الصوديوم
طبق زراعة أنسجة 600 cm²	Thermo Fisher Scientific	166508
محلول ملحي منظم بالتريس (TBS)، pH 7.4			137 mM NaCl، و5 mM KCl، و491 mM MgCl، و680 mM CaCl، و25.1 mM Tricine
مخزون HSV-1			تعطي المخزونات ذات العيارات الأعلى من 1x109 PFU/mL أفضل النتائج
5´-Ethynyl-2´-deoxycytidine (EdC)	Sigma-Aldrich	T511307	يُذاب في DMSO لتحضير مخزون بتركيز 40 mM، ثم يُقسم إلى حصص ويُخزن عند -20 °C
حاضنة زراعة الخلايا
كابينة السلامة البيولوجية
قوالب تسخين			65 °C و95 °C