توسيم جينومات فيروس HSV-1 المتضاعفة باستخدام نظير نوكليوزيدي

الملخص

المصدر: ديمبوفسكي، ج. أ.، ديلوكا، ن. أ. تنقية الحمض النووي الفيروسي لتحديد البروتينات الفيروسية والخلوية المرتبطة به. مجلة التجارب المرئية (2017)

يوضح هذا الفيديو عملية إصابة خلايا ثديية في طور السكون بفيروس HSV-1 (الفيروس القهري البسيط-1)، يليها تضاعف الجينوم الفيروسي باستخدام آليات التضاعف الخاصة بالعائل والفيروس. يتم دمج نظير نوكليوزيد اصطناعي في الحمض النووي الفيروسي المُصنع حديثًا لوسم الجينومات المتضاعفة، والتي يتم عزلها لاحقًا لإجراء تحليل بروتومي للبروتينات الفيروسية وبروتينات العائل المرتبطة بها.

البروتوكول

1. زراعة الخلايا، والعدوى الفيروسية، والوسم بـ EdC (5-Ethynyl-2′-deoxycytidine) (الشكل 1)

يتضمن البروتوكول التالي العمل مع الفيروسات. يرجى الرجوع إلى بروتوكولات السلامة البيولوجية الخاصة بمؤسستك فيما يتعلق بالتداول الآمن للفيروسات والعوامل البيولوجية الأخرى. تمت الموافقة على هذا البروتوكول من قبل مجلس المراجعة المؤسسية بجامعة بيتسبرغ.

1. قم بمعالجة خلايا MRC-5 (سلالة خلايا مجلس البحوث الطبية 5) في قارورة زراعة أنسجة بحجم 150 cm² وصلت لمرحلة الالتحام باستخدام التريبسين، ثم انقل الخلايا إلى طبق زراعة أنسجة بحجم 600 cm2 يحتوي على 100 mL من وسط DMEM (وسط إيجل المعدل من دولبيكو) مضافاً إليه 10% FBS. حضّن الخلايا عند 37 °C في وجود 5% CO....

النتائج

الشكل 1: طرق وسم DNA لفيروس HSV-1. (A) لتقييم حالة الفيروس الداخل، تُعدى خلايا MRC-5 الساكنة في طور G0 بفيروس HSV-1 موسوم مسبقاً، وتُقيم الجينومات في غضون أقل من 4 hpi لدراسة DNA الفيروسي غير المتضاعف. (B) لت.......

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
خلايا MRC-5	ATCC	CCL-171
مصل جنين البقر (FBS)	Gibco	26140-179
وسط ديولبيكو المعدل (DMEM)	Gibco	12800-082	مُضاف إليه 10% FBS، و2 mM L-glutamine، و12 mM (للنمو في الدوارق) أو 30 mM (للنمو في الأطباق) من بيكربونات الصوديوم
طبق زراعة أنسجة 600 cm²	Thermo Fisher Scientific	166508
محلول ملحي منظم بالتريس (TBS)، pH 7.4			137 mM NaCl، و5 mM KCl، و491 mM MgCl، و680 mM CaCl، و25.1 mM Tricine
مخزون HSV-1			تعطي المخزونات ذات العيارات الأعلى من 1x109 PFU/mL أفضل النتائج
5´-Ethynyl-2´-deoxycytidine (EdC)	Sigma-Aldrich	T511307	يُذاب في DMSO لتحضير مخزون بتركيز 40 mM، ثم يُقسم إلى حصص ويُخزن عند -20 °C
حاضنة زراعة الخلايا
كابينة السلامة البيولوجية
قوالب تسخين			65 °C و95 °C