عزل البروتينات من معقدات الحمض النووي الفيروسي والبروتين

الملخص

المصدر: Dembowski, J. A., et al. تنقية الحمض النووي الفيروسي لتحديد البروتينات الفيروسية والخلوية المرتبطة به. J. Vis. Exp. (2017).

يوضح هذا الفيديو كيفية عزل معقدات البروتين والحمض النووي الفيروسي (protein–viral DNA complexes) من نواى الخلايا باستخدام كيمياء النقر (click chemistry) والتنقية بالخرز المغناطيسي. يتضمن البروتوكول وسم الجينومات الفيروسية بنوكليوتيدات معدلة بالألكين، والبيوتينية عبر تفاعل النقر، والارتباط بخرز مغناطيسي مغلف بالستريبتاديفين. وبعد الغسل والاستخلاص الحراري، يتم جمع المعقدات المنقاة وتجميدها سريعاً وتخزينها للتحليلات اللاحقة.

البروتوكول

1. تنقية الـ vDNA والبروتينات المرتبطة به

ملاحظة: يجب تبريد جميع المحاليل المنظمة والكواشف على الثلج قبل الاستخدام، ويجب تنفيذ جميع الخطوات على الثلج ما لم يُنص على خلاف ذلك.

1. حصاد النوى. ملاحظة: قبل عزل النوى، يمكن استخدام الفورمالديهايد لربط البروتينات بالحمض النووي DNA بروابط تساهمية. ويمكن بعد ذلك استخدام ظروف غسيل أكثر صرامة أثناء تنقية DNA على الخرز المغطى بالستريبتأفيدين.
   1. استبدل وسط النمو بـ 20 mL من منظم استخلاص النوى (NEB) وحضنه لمدة 20 min عند 4 °C مع الرج المتقطع. ستصبح النوى مرئية تحت المجهر.
   2. اكشط النوى من الطبق باستخدام كاشطة خلايا وانقلها إلى أنبوب مخروطي سعة 50 mL. قم بالطرد المركزي لمدة 10 min عند 2,500 x g عند 4 °C لترسيب النوى، ثم تخلص من الطافي.
      ملاحظة: يمكن استخدام صبغة Trypan blue للتحقق من عزل النوى من الخلايا.
   3. قم بتفكيك راسب النوى برفق في 10 mL من المحلول الملحي المنظم بالفوسفات (PBS)، وانقله إلى أنبوب مخروطي سعة 15 mL، ورسبه عن طريق الطرد المركزي لمدة 10 min عند 2,500 x g عند 4 °C. قم بإزالة PBS تماماً.
      ملاحظة: يمكن تجميد النوى، ويمكن إيقاف البروتوكول عند هذه النقطة. وللقيام بذلك، أعد تعليق راسب النوى برفق في 500 µL من منظم التجميد وحضن الأنبوب في حمام من الإيثانول والثلج الجاف. تُخزن النوى المجمدة عند -80 °C. وقبل الاستخدام، أذب النوى في درجة حرارة الغرفة، وانقلها بسرعة إلى الثلج، وأضف 10 mL من PBS، ورجها برفق للمزج، ورسبها بالطرد المركزي لمدة 10 min عند 2,500 x g عند 4 °C، وأزل PBS تماماً. قد يؤدي تجميد النوى إلى انخفاض في الحصيلة.
2. ربط البيوتين-أزيد تساهمياً بالحمض النووي الفيروسي vDNA المُعلم بـ 5-ethynyl-2′-deoxycytidine (EdC).
   1. أعد تعليق راسب النوى في 10 mL من خليط تفاعل الكليك [انظر جدول المواد] عن طريق السحب والضخ بالماصة برفق 5 مرات باستخدام ماصة سعة 10 mL.
      ملاحظة: من المهم إضافة الكواشف المضمنة في خليط تفاعل الكليك بالترتيب الموضح.
   2. قم بالتدوير لمدة 1h عند 4 °C. وأثناء التدوير، قم بتحضير وتبريد المنظمات B1 و B2 و B3 [انظر جدول المواد].
   3. رسب النوى عن طريق الطرد المركزي لمدة 10 min عند 2,500 x g عند 4 °C. أزل خليط تفاعل الكليك تماماً واغسل الراسب عن طريق إعادة تعليقه برفق في 10 mL من PBS والطرد المركزي لمدة 10 min عند 2,500 x g عند 4 °C.
   4. أعد تعليق راسب النوى برفق في 1 mL من PBS وانقله إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 mL باستخدام رأس ماصة واسع الفتحة. رسب النوى عن طريق الطرد المركزي لمدة 10 min عند 2,500 x g عند 4 °C. أزل PBS تماماً وقم بالتجميد السريع في النيتروجين السائل.
      ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول عند هذه النقطة، ويمكن تخزين النوى المجمدة عند -80 °C. يساعد التجميد والذوبان في عملية التحلل اللاحقة، لذا يُوصى بتجميد النوى سريعاً حتى عند الانتقال إلى الخطوة 1.3 في اليوم نفسه.
3. تحليل النوى وتجزئة DNA.
   1. أذب النوى على الثلج وأعد تعليقها في 500 µL من Buffer B1 عن طريق السحب والضخ بالماصة. حضنها على الثلج لمدة 45 min.
   2. عرض العينات للموجات فوق الصوتية (sonication) 6 مرات لمدة 30 s لكل مرة بسعة 40% باستخدام مسبار دقيق بحجم 3 mm. ضع العينات على الثلج لمدة 30 s بين النبضات. بعد السونيكة، يجب أن تظهر العينات صافية وليست عكرة.
      ملاحظة: يجب تحسين ظروف السونيكة لكل جهاز سونيكاتور على حدة.
   3. رسب حطام الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 14,000 x g لمدة 10 min عند 4 °C. يجب أن يقل حجم الراسب بشكل كبير. قم بترشيح الطافي عبر مصفاة خلايا بمسامية 100 µM واحتفظ بالراشح.
   4. أضف 500 µL من Buffer B2 إلى الطافي المُرشح. سيتم استخدام 900 µL من هذه العينة في الخطوة 1.4.2.
   5. خذ جزءاً من كل حالة لعزل DNA (مقدار 50 µL أو 1/20 من الحجم) وأضف 50 µL من محلول 2x sodium dodecyl sulfate (SDS)-bicarb [انظر جدول المواد]. انتقل إلى بروتوكول عزل DNA.
   6. خذ جزءاً من كل حالة لبروتين المدخلات (مقدار 50 µL أو 1/20 من الحجم) وأضف 50 µL من منظم عينات 2x Laemmli، وجمدها في النيتروجين السائل، وخزنها عند -80 °C.
4. ربط DNA المُبيوتَن بالخرز المغطى بالستريبتأفيدين.
   1. حضر خرز Streptavidin T1 المغناطيسي بنقل 300 µL من ملاط الخرز إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 mL. حضر أنبوباً واحداً من الخرز لكل عينة. اغسل الخرز 3 مرات بـ 1 mL من Buffer B2 عن طريق الرج بمزيج (vortexing) لإعادة التعليق، واستخدام مغناطيس لفصل الخرز، وشفط منظم الغسيل.
      ملاحظة: تؤدي ظروف الربط المحسنة إلى زيادة الحصيلة وتقليل الربط الخلفي. وقد ثبت تجريبياً أن خرز Streptavidin T1 المغناطيسي لديه قدرة ربط أكبر بكثير من خرز الأجاروز، وكذلك من خرز الستريبتأفيدين الأخرى، وربط خلفي أقل من خرز Streptavidin C1 (الشكل 1A).
   2. أضف 900 µL من العينة من الخطوة 1.3.4. إلى الخرز المغسول وقم بتدويرها طوال الليل عند 4 °C.
      ملاحظة: لا ترج الخرز بمزيج (vortex) بمجرد إضافة العينة إليه.
      ملاحظة: إذا تم عزل كميات كبيرة من DNA أو البروتين في العينة الضابطة السالبة غير المُعلمة، يمكن تقليل هذه الخطوة من ليلة كاملة إلى 4 h لتقليل الربط الخلفي.
5. غسل الخرز واستخلاص vDNA والبروتينات المرتبطة به.
   ملاحظة: يُوصى باستخدام رؤوس ماصات ذات مرشح (filter tips) في الخطوات المتبقية.
   1. ضع العينات في حامل أنابيب طرد مركزي دقيق مغناطيسي، وأزل الطافي، وأعد التعليق برفق في 1 mL من Buffer B2، وقم بالتدوير عند 4 °C لمدة 5 min.
   2. كرر الخطوة 1.5.1 ثلاث مرات.
   3. ضع العينات في حامل أنابيب طرد مركزي دقيق مغناطيسي، وأزل الطافي، وأعد التعليق برفق في 1 mL من Buffer B3، وقم بالتدوير عند 4 °C لمدة 5 min.
   4. انقل 100 µL من خليط الخرز (1/10 من الحجم) إلى أنبوب جديد لعزل DNA المرتبط. ضع هذا الأنبوب على المغناطيس، وأزل الطافي، وأعد تعليق الخرز في 100 µL من محلول 1x sodium dodecyl sulfate أو SDS-bicarb، وانتقل إلى بروتوكول عزل DNA.
   5. ضع الأنبوب الذي يحتوي على الـ 900 µL المتبقية من خليط الخرز من الخطوة 1.5.3. على المغناطيس، وأزل الطافي، وأعد تعليق الخرز في 50 µL من منظم عينات 2x Laemmli لاستخلاص البروتين ومعقدات DNA-protein.
   6. اغلِ العينات عند 95 °C لمدة 15 min، ورجها بمزيج، وقم بتدويرها بسرعة في جهاز الطرد المركزي الدقيق، واستخدم المغناطيس. انقل المستخلص إلى أنبوب جديد، وقم بتجميده سريعاً، وخزنه عند -80 °C.
      ملاحظة: استخدم أقفال الأغطية للتأكد من عدم انفتاح الأنابيب أثناء الغليان.
      ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول عند هذه النقطة، ويمكن تخزين العينات عند -80 °C لعدة أسابيع.
   7. حلل عينات البروتين باستخدام صبغة Coomassie Blue، أو لطخة ويسترن (western blotting)، أو مطيافية الكتلة وفقاً للإجراءات القياسية. تظهر النتائج التمثيلية في الشكلين 1 و 2.
      ملاحظة: لتحديد ما إذا كانت حصيلة البروتين كافية لمطيافية الكتلة، يتم استخدام 7.5 µL من كل عينة للتحليل بواسطة صبغة Coomassie Blue و 7.5 µL للطخة ويسترن لبروتين تمثيلي مرتبط بالجينوم الفيروسي (ICP4 أو ICP8 أو UL42). يتم تشغيل نفس الحجم من المحللات من الخطوة 1.3.6. جنباً إلى جنب للتحكم في مستويات بروتين المدخلات. ثم يتم تحليل العينة المتبقية (35 µL) بواسطة مطيافية الكتلة.

النتائج

الشكل 1: نتائج تمثيلية لتنقية البروتين. (A) مقارنة في إنتاجية البروتين عند إجراء خطوات التنقية باستخدام عدة أنواع مختلفة من الخرز المغطى بالستريبتفيدين. أُجريت العدوى بوجود EdC (+) لمقارنة إنتاجية البروتين، أو في غياب EdC (-) لمقارنة الارتباط الخلفي. تم تنفيذ عمليات العدوى ووسم EdC، وتم تنقية معقدات DNA-protein باستخدام كميات متكافئة من أنواع مختلفة من الخرز المغطى بالستريبتفيدين. اللوحة العلوية: مقارنة إنتاجية البروتين بعد التنقية باستخدام خرز الأجاروز المغطى بالستريبتفيدين أو Streptavidin M-280. اللوحة السفلية: مقارنة إنتاجية البروتين بعد التنقية باستخدام Streptavidin M-270، أو M-280، أو Streptavidin C1، أو Streptavidin T1. أُجري تحليل Western blotting باستخدام جسم مضاد ضد البروتين الفيروسي ICP4. يظهر البروتين ICP4 المنقى في المسار الأول للمقارنة. تطلب الأمر تعريض اللوحة السفلية لفترة أطول لملاحظة كثافة مماثلة لـ ICP4 في المسار "280" كما في اللوحة العلوية. (B) تظهر نتائج تمثيلية لتنقية البروتين كدالة لزمن وسم EdC. تم تنفيذ عمليات العدوى ووسم EdC، ونُقيت معقدات DNA-protein باستخدام خرز Streptavidin T1. أُجري وسم EdC لمدة 0، أو 20، أو 40، أو 60 دقيقة، وتظهر نتائج صبغ Coomassie Blue (في الأعلى) ونتائج Western blotting (في الأسفل). أُجري تحليل Western blotting باستخدام أجسام مضادة متخصصة لـ ICP4، أو UL42، أو GAPDH. تم أخذ عينة المستخلص من الخطوة 1.5.5. وعينة المحلل من الخطوة 1.3.6. يشير السهم إلى الستريبتفيدين، بينما يشير L إلى سلم البروتين.

الشكل 2: أمثلة على طرق مختلفة لعرض بيانات البروتيوميات. (A) تلخص المخططات الدائرية البروتينات التي تم تحديدها بواسطة مطياف الكتلة للنواتج البروتينية المرتبطة بالجينومات الفيروسية التي تم تنقيتها عند 6 hpi. تشير القيم إلى عدد البروتينات المحددة لكل فئة وظيفية. يشير T إلى العدد الإجمالي للبروتينات المحددة. تشير الألوان إلى الفئات التالية: الأرجواني - معالجة RNA، الأحمر - النسخ، الأخضر - إعادة تشكيل الكروماتين، البرتقالي - تضاعف DNA، الأصفر - النقل النووي، الأزرق المخضر - الهيكل الخلوي، الأزرق الداكن - البروتينات التركيبية لـ HSV، والرمادي - أخرى/غير معروفة. (B) توضح مخططات فين تداخل البروتينات التي تم تحديد ارتباطها بالجينومات الفيروسية عند 6 أو 8 أو 12 hpi. (C) توضح خريطة STRING البروتينات المخصبة في شوكات التضاعف الفيروسي بعد نبضة EdC لمدة 5 دقائق. تظهر البروتينات البشرية المخصبة بمقدار 5 أضعاف مقارنة بالعينة الضابطة السالبة غير الموصومة في خريطة التفاعل الوظيفي، والتي تم إنشاؤها باستخدام STRING مع إعدادات بيانات لعرض التفاعلات عالية الثقة فقط. تم استخدام أسماء الجينات لرسم خرائط التفاعلات. تشير الدوائر إلى البروتينات التي تعمل في نفس العملية البيولوجية.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
خلايا MRC-5	ATCC	CCL-171
مصل بقري جنيني (FBS)	Gibco	26140-179
وسط دولبيكو المعدل إيجل (DMEM)	Gibco	12800-082	يُستبدل بـ 10% FBS، و2 mM L-glutamine، و12 mM (للنمو في الدوارق) أو 30 mM (للنمو في الأطباق) من بيكربونات الصوديوم
طبق زراعة أنسجة بمساحة 600 cm²	Thermo Fisher Scientific	166508
محلول ملحي منظم بـ Tris (TBS)، pH 7.4			137 mM NaCl، و5 mM KCl، و491 mM MgCl، و680 mM CaCl، و25.1 mM Tricine
مخزون HSV-1			تعمل المخزونات التي تزيد عياراتها عن 1x10⁹ PFU/mL بشكل أفضل
عمود Sephadex G-25 (عمود إزالة الملاح PD-10)	GE Healthcare	17085101
ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO)	Fisher Scientific	D128-1
5´-Ethynyl-2´-deoxycytidine (EdC)	Sigma-Aldrich	T511307	يُذاب في DMSO لتحضير مخزون بتركيز 40 mM، ثم يُقسم إلى حصص ويُخزن عند -20 °C
2´-deoxycytidine (deoxyC)	Sigma-Aldrich	D3897	يُذاب في الماء لتحضير مخزون بتركيز 40 mM، ثم يُقسم إلى حصص ويُخزن عند -20 °C
منظم استخلاص نووي (NEB)			يُحضر طازجاً (20 mM Hepes pH 7.2، و50 mM NaCl، و3 mM MgCl₂، و300 mM Sucrose، و0.5% Igepal)
كاشطة خلايا	Bellco glass	7731-22000	تُعقم بالأتوموكلاف قبل الاستخدام
محلول تريبان الأزرق	Sigma-Aldrich	T8154
PBS، pH 7.2 (10x)			1.37 M NaCl، و27 mM KCl، و100 mM Na₂HPO₄، و18 mM KH₂PO₄ (يُخفف إلى 1x في ماء معقم قبل الاستخدام)
كبريتات النحاس (II) خماسية الهيدرات (CuSO₄·5H₂O)	Fisher Scientific	C489	يُحضر مخزون بتركيز 100 mM ويُخزن عند 4 °C لمدة تصل إلى شهر واحد
(+) L-ascorbate الصوديوم	Sigma-Aldrich	A4034	يُحضر مخزون بتركيز 100 mM طازجاً ويُخزن على الثلج حتى الاستخدام
Biotin azide	Invitrogen	B10184	يُحضر مخزون بتركيز 10 mM في DMSO، ثم يُقسم إلى حصص ويُخزن عند -20 °C لمدة تصل إلى سنة واحدة
مزيج تفاعل Click			يُحضر فوراً قبل الاستخدام عن طريق إضافة الكواشف بالترتيب المحدد (10 mL: 8.8 mL 1x PBS، و200 mL 100 mM CuSO₄، و25mL 10 mM Biotin Azide، و1 mL 100 mM sodium ascorbate)
كوكتيل مثبط البروتياز الكامل	Roche	11697498001	يُذاب في 1 mL ماء لتحضير مخزون 50x، ويمكن تخزينه عند 4 °C لمدة تصل إلى أسبوع، أو تُضاف حبة واحدة مباشرة إلى 50 mL من المنظم
منظم التجميد			يُحضر طازجاً (7 mL جلسرين 100%، و3 mL NEB، و200 μL من مثبط البروتياز 50x)
المنظم B1			يُحضر طازجاً (25 mM NaCl، و2 mM EDTA، و50 mM Tris-HCl pH 8، و1% Igepal، و1x مثبط البروتياز)
المنظم B2			يُحضر طازجاً (150 mM NaCl، و2 mM EDTA، و50 mM Tris-HCl pH 8، و0.5% Igepal، و1x مثبط البروتياز)
المنظم B3			يُحضر طازجاً (150 mM NaCl، و2 mM EDTA، و50 mM Tris-HCl pH 8، و1x مثبط البروتياز)
معالج Vibra Cell بالأمواج فوق الصوتية مزود بمسبار دقيق 3 mm	Sonics	VCX 130
مصفاة خلايا	Falcon	352360
Dynabeads MyOne Streptavidin T1	Life Technologies	65601
مغناطيس DynaMag-2	Life Technologies	12321D
دوار أنابيب صغير	Fisher Scientific	260750F
منظم عينات Laemmli بتركيز 2x			يُخلط 400 mg من SDS، و2 mL جلسرين 100%، و1.25 mL من 1 M Tris (pH 6.8)، و10 mg من بروموفينول الأزرق في 8 mL ماء. يُخزن عند 4 °C لمدة تصل إلى 6 أشهر. قبل الاستخدام، يُضاف 1 M DTT ليصل التركيز النهائي إلى 200 mM.
أقفال أغطية لأنابيب 1.5 mL	Fisher Scientific	NC9679153
كواشف لطخة ويسترن القياسية
طقم صبغ NOVEX Colloidal Blue	Invitrogen	LC6025
طبق زراعة أنسجة بـ 12 بئراً	Corning	3513
غطاءات شرائح	Fisher Scientific	12-545-100	تُعقم بالأتوموكلاف قبل الاستخدام
شرائح مجهرية	Fisher Scientific	12-552-5
بارافورمالدهيد 16%	Electron Microscopy Sciences	15710	يُخفف إلى 3.7% في 1x PBS قبل الاستخدام
ألبومين المصل البقري (BSA)	Fisher Scientific	BP1605	يُحضر بتركيز 3% في 1x PBS
منظم النفاذية (0.5% Triton-X 100)	Sigma-Aldrich	T8787	يُحضر 0.5% Triton-X 100 في 1x PBS
كوكتيل تفاعل Click - طقم تصوير Click-iT EdU Alexa Fluor 488	Molecular Probes	C10337	يُحضر وفقاً لبروتوكول الشركة المصنعة
محلول 2x SDS-bicarb			2% SDS، و200 mM NaHCO₃
10x Tris EDTA (TE)، pH 8.0			100 mM Tris، و10 mM EDTA (يُخفف إلى 1x قبل الاستخدام)
جهاز طرد مركزي دقيق لأنابيب 1.5 mL
جهاز طرد مركزي مكتبي لأنابيب 15 و50 mL
حضانة زراعة الخلايا
كابينة السلامة البيولوجية
كتل التسخين			65 °C و95 °C