جهاز مطلي بالسيليكون مطبوع ثلاثي الأبعاد لنمذجة عدوى المسالك البولية المرتبطة بالقسطرة

الملخص

مصدر:
أوشن إي كلارك¹ ، رومي أ. دوب¹ ، توم هاسيل¹ ، جوان إل فوثرجيل¹ ، دانيال آر نيل<sup>2

1</sup>جامعة ليفربول ، ² جامعة دندي

يوضح هذا الفيديو استخدام جهاز مطبوع ثلاثي الأبعاد ومغطى بالسيليكون يحاكي السطح الداخلي للقسطرة البولية لمحاكاة عدوى المسالك البولية المرتبطة بالقسطرة.

البروتوكول

تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على جمع العينات وفقا لإرشادات معهد الهجرة والمراجعة المؤسسية.

1. التصنيع الإضافي لنماذج Flexipeg

1. طباعة أوتاد (مطلوب 24 أوتاد لكل غطاء ربط) وأغطية الوتد في راتينج ثابت بدرجة حرارة عالية باستخدام الطباعة الحجرية المجسمة (ارتفاع طبقة 100 ميكرومتر).
   ملاحظه: يتم استخدام الراتنج المستقر بدرجة حرارة عالية للأوتاد ، ويمكن تعقيم أغطية الوتد بالتعقيم قبل التجريب.
2. طباعة ثلاثية الأبعاد لكل من مكونات القالب وأجزاء من رف أنبوب الاختبار باستخدام نمذجة الترسيب المنصهر (FDM) مع حشو 60٪.
   ملاحظه: أي راتينج متين مناسب ل FDM ، حيث يمكن تعقيم القوالب ورفوف أنبوب الاختبار بالإيثانول ولا تتطلب الاستقرار في درجات الحرارة العالية.
3. تأكد من طباعة مكونات النموذج بشكل صحيح وإزالة أي بقايا زائدة من عملية الطباعة باستخدام 70٪ إيثانول.
4. قم بتجميع قالب حصيرة السيليكون كما هو موضح في الشكل 1 ، مع تثبيت الجوانب في مكانها بشريط لاصق إذا لزم الأمر.

2. إعداد نموذج Flexipeg

1. تحضير حصيرة السيليكون
   1. تزن 18 جراما من قاعدة السيليكون (قاعدة 10: 1 لمحفز بولي ديميثيل سيلوكسان (PDMS) ، علاج التكثيف) في دورق واخلطه برفق في 2 جم من المحفز حتى تمتزج جيدا.
      ملاحظه: تجنب الإفراط في تحريك مزيج السيليكون لمنع تكون الفقاعات داخل القالب.
   2. صب خليط السيليكون المدمج في القالب المطبوع FDM ، وامسح أي خليط سيليكون زائد من جوانب وأعلى القالب. اتركيه للشفاء طوال الليل (18 ساعة على الأقل) في درجة حرارة الغرفة (RT).
   3. قم بإزالة السجادة من القالب ، وقم بقص أي سيليكون زائد من الجانبين. تأكد من أن السجادة تتناسب مع غطاء الوتد ، كما هو موضح في الشكل 1.
2. طلاء الوتد
   1. أدخل الأوتاد في حصيرة سيليكون (24 أوتادا لكل حصيرة) وقم بتثبيت السجادة بغطاء الوتد أو صينية بلاستيكية ذات أبعاد مماثلة للحصيرة باستخدام شريط لاصق.
   2. قم بوزن 27 جراما من قاعدة السيليكون في صينية بلاستيكية ضحلة (تقريبا نفس أبعاد لوح 96 بئرا) واخلطه جيدا في 3 جم من المحفز حتى تمتزج جيدا.
   3. اقلب أغطية الوتد بحيث تكون الأوتاد متجهة لأسفل ، واغمس الأوتاد على الفور في خليط السيليكون. اقلب غطاء الوتد واترك السيليكون الزائد يتساقط على الأوتاد والأوتاد لعلاج طوال الليل في درجة حرارة الغرفة.
      ملاحظه: سيستمر السيليكون سريع المعالجة (6-8 ساعات علاج كامل ؛ 40-60 دقيقة من وقت العمل) في التنقيط / التدفق قبل المعالجة ؛ لذلك ، ليس من الضروري طلاء الوتد بالكامل في PDMS عند الغمس ، لأن أي فائض سيغطي بقية الوتد أثناء المعالجة.
   4. بمجرد الشفاء ، كرر الخطوات من 2.2.2 إلى 2.2.3. حتى يتم طلاء الأوتاد ثلاث مرات في PDMS. تأكد من معالجة طبقة الطلاء الأولى تماما قبل الانتقال إلى خطوة الطلاء الثانية.
      ملاحظه: يجب أن يكون سمك طلاء الوتد النهائي <2 مم مع عدم وجود عيوب مرئية. إذا ظل السيليكون مبتذلا بعد الحضانة طوال الليل في RT ، اتركه للعلاج لمدة 24 ساعة ، وتخلص من الطلاء إذا كانت الأوتاد لا تزال لزجة الملمس.
   5. باستخدام مشرط معقم ، قم بقص قاعدة الأوتاد المطلية بالسيليكون (بالقرب من القاع قدر الإمكان) لإزالة الأوتاد من إعداد الطلاء.
      ملاحظه: يجب تكرار هذه العملية حتى يتم تحضير العدد المطلوب من الأوتاد وحصائر السيليكون. يمكن استخدام PDMS الزائد المستخدم في عملية طلاء الوتد لصب حصائر سيليكون جديدة قبل المعالجة.
3. إعداد النموذج
   1. أدخل الأوتاد المطلية في حصيرة السيليكون وقم بتأمين السجادة في غطاء الوتد ، كما هو موضح في الشكل 1.
   2. قم بتغطية الجانب السفلي من غطاء الوتد / حصيرة السيليكون (المثبتة بقاعدة الوتد) بشريط قابل للتعقيم للحفاظ على الأوتاد في مكانها. ضع غطاء الوتد في كيس قابل للتعقيم محكم الغلق ، وقم بتعقيم الأوتوكلاف قبل الاستخدام.
      ملاحظه: سوف تتناسب الأوتاد الموجودة في غطاء الوتد مع لوحة 96 بئرا في اتجاه واحد فردي. بعد لصق إعداد الوتد ، تحقق من محاذاة الأوتاد في لوحة احتياطية سعة 96 بئرا وقم بتسمية شريط الأوتوكلاف وفقا لاتجاه الغطاء الصحيح.

3. تلقيح النماذج

1. تحضير الثقافة البكتيرية
   1. قم بإعداد مزارع بين عشية وضحاها من العزلات البكتيرية قيد الاختبار عن طريق تعليق حلقة من المستعمرات البكتيرية المزروعة على وسائط صلبة في 10 مل من مرق Luria-Bertani (LB). احتضان طوال الليل (18 ساعة) عند 37 درجة مئوية مع التحريض.
      ملاحظه: يوصى باستخدام ما لا يقل عن ثلاثة مكررات بيولوجية في نموذج الأغشية الحيوية Flexipeg.
   2. تطبيع الثقافات إلى OD_{600 نانومتر}من 0.1 (حوالي 10⁸ وحدات تشكيل مستعمرة (CFU) / مل بعد تخفيف الصفيحة) في حجم نهائي 1 مل من المحلول الملحي المخزن بالفوسفات (PBS).
2. إعداد الألواح الدقيقة والتلقيح
   1. اقتباس 135 ميكرولتر من البول البشري المجمع (PHU) في كل بئر قيد الاختبار في صفيحة 96 بئرا وفقا لتخطيط اللوحة في الشكل 1 (8). يمثل كل بئر تكرارا تقنيا واحدا (مطلوب ما لا يقل عن n = 3 مكررات تقنية لكل تكرار بيولوجي).
      ملاحظه: يمكن استخدام وسائط البول الاصطناعي (AUM) بدلا من PHU إذا رغب المستخدم في ذلك.
   2. قم بتلقيح كل بئر قيد الاختبار ب 15 ميكرولتر من المزرعة الليلية الطبيعية ، مما ينتج عنه حجم بئر نهائي يبلغ 150 ميكرولتر. احتفظ بما لا يقل عن 100 ميكرولتر من الثقافة الليلية الطبيعية للتخفيفات التسلسلية للتحقق من صحة CFU / مل للتلقيح.
   3. قم بإعداد ضوابط سلبية عن طريق إدخال 150 ميكرولتر من PHU المعقم فقط في الآبار ذات الصلة.
   4. بعد إعداد اللوحة الدقيقة ، أدخل الأوتاد في الآبار الخاصة بها (كما هو محدد قبل تعقيم الأوتاد بالتعقيم) ، وتأكد من أن غطاء الوتد متدفق مع سطح اللوحة. قم بتغطية غطاء الوتد بغطاء اللوحة الدقيقة ، وثبته في مكانه بشريط الأوتوكلاف إذا لزم الأمر.
   5. ضع نماذج الوتد في حوض / كيس بلاستيكي محكم الغلق مع لفافة زرقاء مبللة لمنع التبخر ، واحتضان بشكل ثابت لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية.
3. التحقق من صحة اللقاح
   1. اقتباس 180 ميكرولتر من PBS في الصفوف 2-6 من العمود الأول من صفيحة دقيقة مكونة من 96 بئرا وأضف 100 ميكرولتر المحجوزة من الثقافة الليلية الطبيعية إلى البئر الأول.
   2. قم بإزالة 20 ميكرولتر من المزرعة الليلية الطبيعية من البئر الأول وقم بإزالتها في البئر الثاني ، مع سحب العنصة برفق لأعلى ولأسفل للخلط.
   3. كرر الخطوة 3.3.2 حتى يتم تخفيف اللقاح الأولي إلى البئر النهائي (1 × 10⁵).
   4. ضع لوحة 10 ميكرولتر من كل تخفيف على وسائط صلبة مناسبة في ثلاث نسخ. احتضن ثابتا طوال الليل عند 37 درجة مئوية.
   5. بعد الحضانة ، احسب عدد المستعمرات في كل بقعة لحساب CFU / mL الفعلي لللقاح.

4. قياس الأغشية الحيوية

1. معالجة الوتد
   1. بعد الحضانة ، قم بإزالة نموذج الوتد من الصفيحة الدقيقة واقلبه تحت اللهب أو داخل خزانة أمان ميكروبية (الأوتاد متجهة لأعلى). تجاهل الألواح الدقيقة.
   2. انقل غطاء الوتد إلى صفيحة دقيقة جديدة تحتوي على 180 ميكرولتر من الأجزاء المعقمة من PBS المعقمة لإزالة أي خلايا غير ملتصقة. كرر مرتين في PBS طازج ليصبح المجموع ثلاث خطوات غسيل.
      ملاحظه: لمنع تلف الأغشية الحيوية المرتبطة بالسطح ، تجنب تعطيل الأوتاد عند إزالة غطاء الوتد من كل صفيحة دقيقة (أي لمس حواف البئر).
2. تعداد CFU / مل (مرتبط بالأغشية الحيوية)
   1. العمل بشكل معقم تحت اللهب أو في خزانة أمان ميكروبيولوجية ، قم بإعداد رف الأنبوب (المصنع في الخطوة 1.2.) بأنابيب اختبار زجاجية معقمة كما هو موضح في الشكل 1 ، وقم بإرفاق الجزء العلوي من الرف الذي يناسب غطاء الوتد.
   2. بشكل جزئي ، قم بإدخال 600 ميكرولتر من PBS المعقم في كل أنبوب اختبار.
   3. ضع غطاء الوتد في الرف ، مع وضع أوتاد تتماشى مع الأنابيب الموجودة في الرف. قم بإزالة أي شريط أوتوكلاف على غطاء الوتد.
   4. باستخدام ملقط معقم ، ادفع الأوتاد عبر غطاء الوتد وفي أنابيب الاختبار المقابلة المحاذاة أدناه.
   5. استبدل أغطية الأنبوب ، وقم بدوامة كل أنبوب لمدة 60 ثانية لتفكيك الخلايا المرتبطة بالأغشية الحيوية من سطح الوتد.
   6. قم بإزالة 100 ميكرولتر من كل أنبوب وقم بتخفيف تسلسلي كما هو موضح سابقا في الخطوة 3.3 في PBS المعقم.
   7. باستخدام صفيحة ماصة مصلية بقع 10 ميكرولتر من كل تخفيف على وسائط صلبة مناسبة ، واحتضان ثابتا عند 37 درجة مئوية طوال الليل.
   8. بعد الحضانة ، احسب عدد المستعمرات على كل لوحة تخفيف واستخدمها لحساب CFU / مل.
3. تلطيخ البنفسجي الكريستالي
   1. Aliquot 180 ميكرولتر من 0.1٪ (وزن / حجم) من البنفسجي الكريستالي (في ماء معقم) في 24 بئرا قيد الاختبار لصفيحة دقيقة مكونة من 96 بئرا.
   2. أدخل نموذج الوتد المغسول (الأوتاد وغطاء الوتد) في الآبار المقابلة للصفيحة الدقيقة. احتضان ثابتا في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة.
   3. بعد الحضانة ، قم بإزالة نموذج الوتد من الصفيحة الدقيقة وتخلص من الصفيحة الدقيقة.
   4. في حوض بحجم مناسب ، اشطف الوتد بالكامل في ماء الصنبور أثناء التحريك برفق. كرر ثلاث مرات.
   5. اقلب نموذج الوتد واترك الأوتاد تجف تماما عند RT.
   6. أليكوت 180 ميكرولتر من 30٪ من حمض الأسيتيك في صفيحة دقيقة جديدة بسعة 96 بئرا وأدخل نموذج الوتد المجفف في الآبار المقابلة. احتضان في RT لمدة 30 دقيقة.
   7. قم بإزالة نموذج الوتد من الصفيحة الدقيقة واقرأ OD_540nm من الآبار الملطخة باستخدام قارئ microplate أو مقياس الطيف الضوئي.
   8. لحساب تكوين الأغشية الحيوية على الأوتاد ، احسب متوسط OD_{540 نانومتر} من أوتاد التحكم السلبية الملطخة واطرح من متوسط الأوتاد قيد الاختبار.

النتائج

الشكل 1: تمثيل تخطيطي لإعداد نموذج Flexipeg. (1) فلكسيبيج واحد ، مطلي ب polydimethylsiloxane (PDMS) لتكرار سطح القسطرة البولية لتكوين الأغشية الحيوية. (2) جهاز الأغشية الحيوية Flexipeg ، الذي يتكون من (3) حصيرة السيليكون التي تثبت الأوتاد ال...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
96 بئر Microplates	غرينر	650161	على شكل حرف U / أسفل مستدير.
حمض الخليك	SLS	695092-2.5LSIG	≥ كاشف ACS بنسبة 99.7٪.
كريستال بنفسجي	ميرك	61135-25 جرام
ربط فردي	داخلي	مكونات Flexipeg لتكون مطبوعة ثلاثية الأبعاد	تصنيع المواد المضافة باستخدام راتنج مستقر بدرجة حرارة عالية (مطلوب 24 أوتاد لكل طراز Flexipeg). تم تصنيعها باستخدام راتنج Formlabs عالي درجة الحرارة بواسطة Protolabs (NL).
مرق لوريا بيرتاني (رطل)	نيوجين	NCM0088B	مرق رطل (ميلر).
غطاء يناسب لوحة 96 بئر	داخلي	مكونات Flexipeg لتكون مطبوعة ثلاثية الأبعاد	تصنيع المواد المضافة باستخدام راتنج مستقر بدرجة حرارة عالية.
قالب لإعداد حصيرة سيليكون	داخلي	مكونات Flexipeg لتكون مطبوعة ثلاثية الأبعاد	تصنيع المواد المضافة من أي مادة متينة. تم تصنيعها باستخدام راتنج النماذج الأولية ABS بواسطة Protolabs (NL).
قالب لإعداد جانب حصيرة السيليكون	داخلي	مكونات Flexipeg لتكون مطبوعة ثلاثية الأبعاد	تصنيع المواد المضافة من أي مادة متينة.
محلول ملحي مخزن بالفوسفات	ميرك	P4417-50 علامة التبويب
تجميع البول البشري	-	-	تم جمعها من المتبرعين الأصحاء بعد الموافقة الأخلاقية من قبل لجنة أخلاقيات البحث بالجامعة المركزية.
رف للأنابيب الزجاجية	داخلي	مكونات Flexipeg لتكون مطبوعة ثلاثية الأبعاد	تصنيع المواد المضافة من أي مادة متينة.
سيليكون (PDMS)	ميغابايت الألياف الزجاجية	جي بي 3481-ف	بولي كرافت للأغراض العامة RTV التكثيف علاج العفن صنع مطاط السيليكون.
الجزء العلوي الذي يناسب غطاء الوتد	داخلي	مكونات Flexipeg لتكون مطبوعة ثلاثية الأبعاد	تصنيع المواد المضافة باستخدام راتنج مستقر بدرجة حرارة عالية.
قسطرة فولي	جريت بير للرعاية الصحية في المملكة المتحدة المحدودة		14 قناة ، 100٪ سيليكون