تنقية النواقل الغدانية المحتوية على الجينوم باستخدام كلوريد السيزيوم

الملخص

المصدر: إيركي-شولتز، إي.، وآخرون. استنساخ والإنتاج واسع النطاق لنواقل الفيروس الغداني عالية السعة القائمة على الفيروس الغداني البشري من النوع 5. J. Vis. Exp. (2016)

يوضح هذا الفيديو عملية تنقية النواقل الغدانية عالية السعة باستخدام الطرد المركزي الفائق بتدرج كلوريد السيزيوم، مما يتيح فصل الفيروسات التي تحتوي على الجينوم لاستخدامها في تطبيقات إيصال الجينات، وتوصيف النواقل، والدراسات العلاجية قبل السريرية

البروتوكول

1. تنقية وديلزة ناقلات الفيروسات الغدية عالية السعة (HCAdV)
   1. لتحضير المستخلص الفيروسي لاستخدامه في تدرجات كلوريد السيزيوم (CsCl)، جمد معلق الخلايا والفيروس في النيتروجين السائل، ثم أذبه في حمام مائي عند 37 °C 4x.
   2. قم بطرد المستخلص الفيروسي مركزياً عند 500 x g لمدة 8 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT)، ثم اجمع الطافي الذي يحتوي على النواقل الغدانية عالية السعة (HCAdV).
   3. بالنسبة للطرد المركزي الفائق، يتم تحضير محاليل كلوريد السيزيوم (CsCl) كما يلي. قم بوزن 37.5 جم (من أجل تركيز 1.5 جم/سم³³)، 33.5 غرام (لتركيز 1.35 غرام/سم³³)، و31.25 جم (لـ 1.25 جم/سم³) من مسحوق CsCl، على التوالي، ثم يُستكمل الحجم بماء مقطر dH₂من 0 إلى 25 مل.
      1. قلّب المزيج حتى يصبح المحلول رائقاً، ثم قم بترشيح المحاليل باستخدام مرشح معقم. وأخيراً، اسحب 1 مل من كل محلول وقم بوزنه باستخدام ميزان دقيق للتحقق من صحة الكثافة؛ حيث يجب أن يكون وزن 1 مل هو 1.5 جم، و1.35 جم، و1.25 جم على التوالي.
      2. إذا كانت الكثافة مرتفعة للغاية، فقم بضبطها عن طريق الإضافة التدريجية لأحجام صغيرة من (µl) من الماء منزوع الأيونات المعقم dH₂أ. بعد إضافة الماء المقطر (dH2O)₂قم بقياس الكثافة مرة أخرى. وإذا لزم الأمر، أضف المزيد من الماء المقطر (dH2O).₂أ.
      3. كرر الإجراء حتى تصبح الكثافة صحيحة. إذا كانت الكثافة منخفضة للغاية، فقم بتعديلها بإضافة كمية صغيرة من مسحوق CsCl، ثم قم بترشيحها باستخدام مرشح معقم مرة أخرى وتحقق من الكثافة. أما إذا كانت الكثافة مرتفعة للغاية، فقم بتعديلها بإضافة dH2O.₂كما هو موضح سابقاً. إذا كانت الكثافة لا تزال منخفضة جداً، أضف المزيد من كلوريد السيزيوم (CsCl)، ثم قم بترشيحه معقماً مرة أخرى وتحقق من الكثافة. كرر هذه العملية حتى تصبح الكثافة صحيحة.
   4. قم بتحضير تدرجات خطوية من كلوريد السيزيوم (CsCl) في 6 أنابيب طرد مركزي فائق شفافة. انقل محاليل كلوريد السيزيوم إلى الأنابيب باستخدام الماصة بعناية وببطء وفقاً للترتيب التالي: 0.5 مل من محلول بتركيز 1.5 جم/سم³³ محلول CsCl، ٣ مل بتركيز ١.٣٥ جم/سم٣³ محلول CsCl، و3.5 مل بتركيز 1.25 جم/سم³³ محلول كلوريد السيزيوم (CsCl) (الشكل 1ج).
   5. ضع حوالي 4.5 مل من طافي الناقل المصفى من الخطوة 1.2 فوق طبقة بكثافة 1.25 جم/سم³³ طبقة كلوريد السيزيوم (CsCl). يتم طرد تدرجات التركيز مركزياً في جهاز طرد مركزي فائق السرعة باستخدام دوّار متأرجح (SW-41) عند 12 °C لمدة ساعتين على الأقل عند 226,000 x g (35,000 دورة في الدقيقة) مع تسريع وتباطؤ بطيئين لفصل الجسيمات الفيروسية التي تحتوي على جينوم HCAdV عن الجسيمات الفارغة والحطام الخلوي.
      ملاحظة: في ظل الظروف المثلى، تتكون حزمة منتشرة من حطام الخلايا في الجزء العلوي من الأنابيب. وأسفلها، يمكن ملاحظة حزمتين بيضاويتين؛ حيث تحتوي الحزمة العلوية على جسيمات فارغة، بينما تمثل الحزمة السفلية ناقلات HCAdV (الأشكال 1C و 2أ).
   6. أزل طبقات الحطام الخلوي والجسيمات الفارغة بعناية، واجمع 1 مل من النطاقات السفلية من كل أنبوب، ثم انقل الفيروس باستخدام طرف ماصة نظيف إلى أنبوب معقم سعة 50 مل. أضف ما يصل إلى 24 مل من محلول بتركيز 1.35 جم/سم³³ أضف محلول CsCl إلى الجسيمات الفيروسية التي تم جمعها واخلطها بعناية.
   7. املأ أنابيب جهاز الطرد المركزي بـ 1.35 جم/سم³³ يُضاف محلول فيروس-كلوريد السيزيوم (CsCl) إلى الأعلى، ثم يُوضع في جهاز الطرد المركزي طوال الليل (18-20 ساعة) بقوة 226,000 x g (35,000 دورة في الدقيقة) عند 12 °C في جهاز طرد مركزي فائق باستخدام دوّار متأرجح (SW-41) مع تسارع وتباطؤ بطيئين.
   8. اجمع ناقلات HCAdV الموجودة في النطاق السفلي البارز. وبما أن النطاق العلوي المحتمل يحتوي على جسيمات فارغة، قم بإزالة الطبقات العليا من الأعلى باستخدام الماصة (انظر الشكل 1ج و 2ب). ثم قم بإزالة النطاق السفلي باستخدام الماصة.
   9. قم بإجراء الديلزة لجزيئات الفيروس المجمعة لتبديل المحلول المنظم.
      1. اقطع شريطاً من أنابيب الديلزة (حد القطع للوزن الجزيئي: 50,000) بطول 8 سم تقريبًا، واغسله بماء مقطر معقم (dH2O)₂كرر العملية 3 مرات. بعد ذلك، أغلق أحد طرفي أنبوب الديلزة باستخدام مشبك بلاستيكي، وانقل الفيروس الذي تم جمعه في الخطوة 5.8 إلى الأنبوب باستخدام ماصة سعة 1 مل. تجنب تكون فقاعات هوائية داخل الأنبوب، ثم أغلق الطرف الآخر بمشبك بلاستيكي لإغلاق الديلزة.
      2. أجرِ الديلزة في 1 لتر من محلول الديلزة المنظم (10 ملي مولار Tris-HCl (الرقم الهيدروجيني 7.5)، و10% جليسرول، و1 ملي مولار MgCl2)₂ (كلوريد المغنيسيوم) في ماء منزوع الأيونات H₂و) لمدة ساعتين في درجة حرارة 4 °C مع التقليب البطيء. استبدل محلول الديلزة بـ 2 لتر من محلول الديلزة، ثم أجْرِ عملية الديلزة طوال الليل في درجة حرارة 4 °C مع التقليب البطيء. وبدلاً من ذلك، يمكن استخدام محلول سكروز منظم (140 ملي مولار NaCl (كلوريد الصوديوم)، 5 ملي مولار Na₂HPO₄.2H₂O (فوسفات ثنائي الصوديوم الهيدروجينية، 1.5 ميلي مولار KH₂تجهيز العينات₄ (فوسفات ثنائي هيدروجين البوتاسيوم)، و730 ميلي مولار من السكروز، وبدرجة حموضة 7.8).
      3. اجمع جزيئات الفيروس التي خضعت للديلزة من الخطوة 1.9.2 باستخدام ماصة سعة 1 مل. قم بتجهيز عدة حصص من الأحجام الصغيرة المطلوبة (25-100 µl) وتخزين الفيروس المنقى عند درجة حرارة -80 °C.

النتائج

الشكل 1. نتائج ممثلة لإجراء الاستنساخ وتحرير جينوم HCAdV (النواقل الغدية عالية السعة) من pAdVFTC. (A) تحرير كاسيت التعبير عن الجين المستهدف (GOI) من pHM5 بواسطة الهضم بإنزيمي PI-SceI و I-CeuI. (B) كاسيت التعبير عن GOI المنقى وpAdVFTC المنقى والمزال منه مجموعة الفوسفات والمُهضم بإنزيمي PI-SceI و I-CeuI، على التوالي. (C) هضم تحليلي بإنزيم HincII لمستنسخات pAdVFTC بوجود GOI وبدونه. (D) تحرير جينوم HCAdV الحامل لـ GOI من pAdVFTC-GOI بواسطة الهضم بإنزيم NotI

الشكل 2. نتائج ممثلة بعد استخدام كلوريد السيزيوم (الطرد المركزي بالتدرج في كلوريد السيزيوم (CsCl). (أ) بعد إجراء تدرج خطوي (راجع أيضاً الخطوة 1.5)؛ (ب) بعد التدرج المستمر (انظر أيضاً الخطوة 1.7).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
أنابيب طرد مركزي فائق Ultra Clear	Beckmann Coulter	344059	الطرد المركزي بتدرج الكثافة
جهاز طرد مركزي فائق	Beckmann Coulter		الطرد المركزي بتدرج الكثافة
دوار SW-41	Beckmann Coulter		الطرد المركزي بتدرج الكثافة
غشاء Spectrapor من Spectrum Laboratories	VWR	132129	أنابيب الديلزة
كاسيتات ديلزة جاهزة للاستخدام	Thermo	66383	الديلزة
كلوريد السيزيوم	Carl Roth	8627.1	الطرد المركزي بتدرج الكثافة
وسط LB	Carl Roth	X968.3	وسط نمو بكتيري
Tris-HCl 99%	Carl Roth	9090.3	منظم ديلزة/ منظم تحلل
Glycerol 99.5%	Carl Roth	3783.1	منظم ديلزة
MgCl₂ 98.5%	Carl Roth	KK36.2	منظم ديلزة
NaCl	Carl Roth	3957.1	منظم ديلزة اختياري
KH₂PO₄	Carl Roth	3904.2	منظم ديلزة اختياري
السكروز	Carl Roth	9286.1	منظم ديلزة اختياري
Na₂HPO₄·2H₂O	Carl Roth	4984.2	منظم ديلزة اختياري
أنابيب 1.5 ml	sarstedt	72,730,005	تخزين تحضيرات الفيروس عند -80 °C