نقل الجينات الفيروسي في قلب الفأر لتقييم تأثيرات الجينات على وظائف القلب

الملخص

المصدر: Lu, A., et al. التعبير عن الجينات المنقولة الفيروسية في قلوب القوارض وتقييم مخاطر عدم انتظام ضربات القلب. J. Vis. Exp. (202)

يوضح الفيديو طريقة للحقن داخل عضلة القلب الموجه بالموجات فوق الصوتية لناقل فيروسي مؤتلف في نموذج فأر. تتيح هذه التقنية إيصال الجينات المستهدفة إلى القلب لدراسة آثار تعبير الجينات المنقولة على الوظيفة القلبية.

البروتوكول

1. التعبير عن الجينات المنقولة الفيروسية في أنسجة بطينات القوارض

ملاحظة: يُحفظ الفيروس الغداني المؤتلف أو الفيروس المرتبط بالغدة (AAV) الذي يعبر عن الجين المستهدف والفيروس الضابط المقابل، مثل Ad-GFP (البروتين الفلوري الأخضر) (بعيار 1 x 10¹⁰ وحدة تشكيل لويحة [PFU]/mL) أو AAV9-GFP (بعيار 1 x 10¹³ نسخة جينومية [GC]/mL) (انظر جدول المواد)، في مجمد عند درجة حرارة −80 °C.

1. في يوم حقن الفيروس، يتم إذابة الفيروس على الثلج. اسحب الفيروس الذي يعبر عن الجين المستهدف والفيروس الضابط في محقنتين منفصلتين (الحجم = 50 µL) باستخدام إبر قياس 30 G ½، واحفظهما على الثلج حتى وقت الاستخدام.
   ملاحظة: يجب إزالة أي فقاعات هواء موجودة في المحقنة والإبرة بعناية.
2. قم بإعطاء مادة البوبرينورفين للجرذان أو الفئران (0.05 mg/kg للجرذان، 0.1 mg/kg للفئران، عن طريق الحقن تحت الجلد)، وبعد ساعة واحدة، استحث التخدير باستخدام 3% إيزوفلوران، وحافظ على نسبة الإيزوفلوران عند 2% (في أكسجين بنسبة 10% وبمعدل تدفق 0.5-1.0 L/min) للإجراءات اللاحقة.
3. اضغط برفق على جسم الحيوان (مثل الذيل) باستخدام ملقط، وإذا لم يستجب الحيوان للضغط بأي حركات جسدية، يتم تأكيد إتمام التخدير بشكل صحيح.
4. حافظ على درجة حرارة الجسم عند 37 °C باستخدام وسادة تسخين كهربائية. احلق الشعر في منطقة الصدر باستخدام ماكينة حلاقة الشعر.
   ملاحظة: يجب توخي الحذر عند استخدام وسادة التسخين الكهربائية نظراً لاحتمالية التوزيع غير المتساوي للحرارة.
5. ضع مرهم العين على كلتا العينين لمنع جفاف القرنية.
6. ضع الحيوان في وضعية الاستلقاء على الظهر واستخدم نظام تصوير قبل سريري (راجع جدول المواد) لإجراء تصوير بالموجات فوق الصوتية لقلب الحيوان في اتجاه المحور القصير.
   ملاحظة: تُجرى الخطوات التالية في كابينة سلامة بيولوجية من المستوى الثاني توفر بيئة معقمة، مع تطبيق إجراءات السلامة القياسية، بما في ذلك الإجراءات الخاصة بالتعامل الآمن مع الإبر.
7. عقم منطقة الصدر السفلية اليسرى للحيوان عن طريق جولات متبادلة من فرك بمادة قائمة على اليود أو الكلورهيكسيدين والكحول ثلاث مرات بحركة دائرية.
8. تحت توجيه التصوير بالموجات فوق الصوتية، أدخل إبرة المحقنة قياس 30 G 1/2 التي تحتوي على الفيروس كما تم تحضيره في الخطوة 1.1 في صدر الحيوان عبر الجانب السفلي الأيسر من الصدر.
9. وجّه طرف الإبرة نحو الجدار الحر الأمامي للبطين الأيسر واحفز ببطء 10-15 μL من الفيروس. تحقق من نجاح الحقن في صور الموجات فوق الصوتية من خلال زيادة السطوع بالقرب من طرف الإبرة.
   ملاحظة: يجب ألا تزيد كمية الفيروس المحقونة في كل موقع عن 15 μL لمنع حدوث تلف مادي في أنسجة عضلة القلب.
10. اسحب الإبرة من القلب وأدخلها في مناطق أخرى من البطين الأيسر لإجراء حقنة ثانية وثالثة من نفس كمية الفيروس.
    ملاحظة: يتم تحديد العدد الإجمالي لمواقع الحقن وفقاً للتصميم التجريبي. إذا كان التعبير الجيني الموضعي مطلوباً، تكفي حقنة واحدة؛ أما إذا كان التعبير الجيني المنتشر مطلوباً، فعادة ما تكون هناك حاجة إلى عدة مواقع حقن (من ثلاثة إلى خمسة).
11. بعد الانتهاء من عمليات الحقن، أعد الحيوان إلى قفصه.
12. راقب الحيوان بعناية حتى يستعيد وعيه الكافي للحفاظ على وضعية الاستلقاء البطني ثم أعده إلى غرفة الإيواء.
13. أعطِ هيدروكلوريد البوبرينورفين (0.1 mg/kg مرتين يومياً للفئران، 0.05 mg/kg مرتين يومياً للجرذان، عن طريق الحقن تحت الجلد) للحيوان لمدة اليومين التاليين. أعِد الحيوانات إلى معرض الحيوانات وراقبها يومياً بحثاً عن أي علامات غير عادية للألم أو الضيق، وفي حال ظهورها، تُعالج الحيوانات وفقاً لبروتوكولات لجنة رعاية الحيوان المؤسسية.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
30 G ½ إبرة PrecisionGlide	Becton Dickinson (BD)	305106
الفيروس المرتبط بالغدة (AAV9 المعبر عن البروتين الفلوري الأخضر (GFP))	Vector Biolabs	7007
الفيروس الغدي (Ad-GFP)	فيكتور بيولابز (Vector Biolabs)	1060
خزانة السلامة البيولوجية (المستوى الثاني)	شركة Microzone	لم يتم توفير نص للمراجعة.	رقم الطراز: BK-2-4
بوبرينورفين	فيترجيسيك (Vetergesic)	DIN 02342510
ماكينة حلاقة شعر	شركة WAHL Clipper	78001
سرنجة هاميلتون	Sigma-Aldrich	20701	705 لتر، الحجم 50 μL
وسادة تدفئة كهربائية	العلامة التجارية لايف (Life Brand)	E12107
إيزوفلوران	شركة Fresenius Kabi Ltd.	M60303
فئران (Ctnnb1flox/flox)	مختبرات جاكسون (Jackson Labs)	4152
الفئران (α(MHC-MerCreMer)	مختبرات جاكسون (Jackson Labs)	5650
مرهم عيني	سيستين (Systane)	DIN 024062
جرذ (سبريغ-داولي، ذكر)	Charles River	400
شفرات المشرط	Fine Science Tools	10010-00
مقبض المشرط	Fine Science Tools	10007-12
نظام VEVO310 للتصوير قبل السريري	شركة VisualSonic Inc.	لم يتم توفير نص للمراجعة والترجمة.