تأكيد ترنسدكشن الفيروس في كبد جرذ مُعاد استزراعه باستخدام الصبغ الكيميائي النسيجي المناعي

الملخص

1. نقل الجينات إلى كبد الجرذ المعاد استزراعه خلوياً الإنتاج واسع النطاق للنواقل الفيروسية المشتقة من الفيروسات المرتبطة بالغدة (ناقل AAV) إنتاج نواقل AAV وتنقيتهما وتقدير كميتها: باختصار، يتم إنتاج نواقل AAV في زجاجات دوارة (roller bottles) وتنقيتهما عن طريق الطرد المركزي بالتدرج باستخدام الإيوديكسانول (iodixanol). يتم إزالة الإيوديكسانول المتبقي عن طريق الترشيح عبر أعمدة ترشيح هلامي من نوع PD10. يتم تحديد تركيز ناقل AAV عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR) باستخدام الحمض النووي الجينومي للفيروس المرتبط بالغدة AAV كمعيار. ملاحظة: ناقل AAV2/6 ذاتي المكمل وشبه نمطي المستخدم في هذه الدراسة يشفر البروتين المراسِل الفلوري الأخضر الزمردي (EmGFP)، كبروتين مراسِل لإثبات كفاءة نقل الجينات، وكاسيت تعبير للحمض النووي الريبي قصير تالد (shRNA) لإسكات جين يتم التعبير عنه داخلياً (سيكلوفيلين ب البشري (hCycB)، الشكل 1). تأكد من توفر كمية كافية من نواقل scAAV شبه النمطية من النمط المصلي 6 (2.7 × 10¹³ ناقل AAV لكل نموذج كبد). نقل الجينات إلى نموذج الكبد يُعدل محلول ناقل AAV ليصل إلى تركيز نهائي يبلغ 2.7 × 10¹³ جينوم ناقل في 5 مل عن طريق إضافة الحجم المناسب من المحلول الملحي المُنظم بالفوسفات (PBS). افصل الكبد عن دائرة الوسط الغذائي عن طريق إزالة الأنابيب من الكانيولا. صِل سرنجة سعة 5 مل بكانيولا الوريد البابي واحقن محلول ناقل AAV كاملاً (5 مل). ملاحظة: يمكن اختيارياً إضافة الفينول الأحمر (5 ميكروغرام/مل) لتتبع توزيع محلول ناقل AAV في جميع أنحاء الكبد. يُحضن الكبد لمدة ساعة واحدة بدون ضخ. يتم زيادة معدل التدفق تدريجياً، بدءاً من 1.25 مل/دقيقة لمدة 10 دقائق؛ ثم 2.5 مل/دقيقة لمدة 20 دقيقة، و3.75 مل/دقيقة لمدة 30 دقيقة. يتم استزراع كبد الجرذ المعاد استزراعه خلوياً لمدة 6 أيام. 2. تقييم كبد الجرذ المنقول جينياً والمعاد استزراعه خلوياً تلوين الهيماتوكسيلين والإيوزين (HE) والتحليل الكيميائي النسيجي المناعي تؤخذ عينات (0.5 × 0.5 × 1.5-2 سم) من كل فص كبدي باستخدام مشرط. تُحضن العينات في محلول بارافورمالدهيد (PFA) بتركيز 4% + سكروز بتركيز 4% لمدة 1.5 ساعة عند درجة حرارة 4 مئوية. (تحذير: مادة PFA سامة ومسرطنة. يجب دائماً التعامل مع PFA داخل خزانة استخلاص الأدخنة وارتداء ملابس الوقاية المناسبة). تُغسل العينات ثلاث مرات باستخدام PBS (دقيقة واحدة لكل خطوة غسيل) وتُحضن في سكروز بتركيز 8% طوال الليل عند درجة حرارة 4 مئوية. يُصب وسط التثبيت في قوالب تجميد بلاستيكية، وتوضع العينات في وسط التثبيت بحيث تكون خالية من فقاعات الهواء. يُضاف وسط التثبيت حتى يتم تغطية العينة جيداً. تُخزن العينات المدمجة عند درجة حرارة -80 مئوية حتى وقت الاستخدام. تُجهز مقاطع تجميدية (10 ميكرومتر) باستخدام جهاز قطع تجميدي (cryotome). يتم تقييم إعادة الاستزراع الخلوي عن طريق التلوين بالهيماتوكسيلين والإيوزين. كما تُقيم كفاءة نقل الجينات عن طريق التلوين الكيميائي النسيجي المناعي للجين المستهدف (في هذه الحالة: EmGFP). هيلر، ت. وآخرون. دراسة الناقلات الفيروسية في نموذج كبدي ثلاثي الأبعاد مُعاد استزاره باستخدام خط خلايا سرطان الخلايا الكبدية البشرية HepG2. مجلة التجارب المرئية (J. Vis. Exp.) (2016)

يوضح هذا الفيديو عملية الصبغ الكيميائي النسيجي المناعي لتقييم نقل الجينات الفيروسية في نموذج كبد جرذ مُعاد استزراعه بالخلايا. ويشير تعبير البروتين المراسل، الذي تم تأكيده عن طريق الكشف بالأجسام المضادة والتوضع المشترك مع الصبغ النووي، إلى نجاح عملية ترنسدكشن الفيروس في الخلايا.

البروتوكول

1. نقل الجينات إلى كبد الجرذ المعاد خلويته

1. الإنتاج واسع النطاق لناقل فيروسي مشتق من الفيروسات المرتبطة بالأدينو (ناقل AAV)
   1. إنتاج ناقلات AAV وتنقيتها وتقدير كميتها:
      1. باختصار، يتم إنتاج ناقلات AAV في زجاجات دوارة (roller bottles) وتنقيتها بواسطة الطرد المركزي بتدرج اليوديكسانول. يتم إزالة اليوديكسانول المتبقي عن طريق الترشيح باستخدام أعمدة ترشيح هلامية من نوع PD10. ويتم تحديد تركيز ناقل AAV بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR) باستخدام الحمض النووي الجينومي لـ AAV كمعيار.
         ملاحظة: قام ناقل AAV2/6 ذاتي المكمل وشبه النمطي المستخدم في الدراسة الحالية بتشفير بروتين التقرير الفلوري الأخضر الزمردي، EmGFP، كتقرير لإثبات كفاءة ترنسدكشن (transduction)، بالإضافة إلى كاسيت تعبير للحمض النووي الريبي قصير دبوس الشعر (shRNA) لإسكات جين يتم التعبير عنه داخلياً (سيكلوفيلين ب البشري (hCycB)، الشكل 1). تأكد من توفر كمية كافية من ناقلات scAAV شبه النمطية من النمط المصلي 6 (2.7 x 10¹³ من ناقلات AAV لكل نموذج كبد).
2. ترنسدكشن نموذج الكبد
   1. اضبط محلول ناقل AAV ليصل إلى تركيز نهائي قدره 2.7 x 10¹³ من جينومات الناقل في 5 mL عن طريق إضافة الحجم المناسب من المحلول الملحي المنظم بالفوسفات (PBS).
   2. افصل الكبد عن دائرة الوسط الغذائي عن طريق إزالة الأنابيب من الكانيولا. قم بتوصيل محقنة سعة 5 mL بكانيولا الوريد البابي واححقن محلول ناقل AAV كاملاً (5 mL).
      ملاحظة: اختيارياً، يمكن إضافة الفينول الأحمر (5 µg/ml) لتتبع توزيع محلول ناقل AAV في جميع أنحاء الكبد.
   3. قم بالتحضين لمدة 1 hr بدون ضخ. زد معدل التدفق تدريجياً، بدءاً من 1.25 ml/min لمدة 10 min؛ ثم 2.5 ml/min لمدة 20 min، و3.75 ml/min لمدة 30 min. استزرع كبد الجرذ المعاد استزراعه خلوياً لمدة 6 أيام.

2. تقييم كبد الجرذ المُعاد استزراعه والمنقول جينياً

1. التلوين بالهيماتوكسيلين والإيوزين (HE) والتحليل المناعي الكيميائي النسيجي
   1. خذ عينات (0.5 x 0.5 x 1.5-2 cm) من كل فص كبدي باستخدام مشرط.
   2. حضن العينات في محلول 4% paraformaldehyde (PFA) + 4% sucrose لمدة 1.5 hr عند 4 °C. (تنبيه: مادة PFA سامة ومسرطنة. يجب دائمًا التعامل مع PFA داخل خزانة استخلاص الغازات وارتداء ملابس الوقاية المناسبة.) اغسل العينات ثلاث مرات باستخدام PBS (دقيقة واحدة لكل خطوة غسيل) ثم حضنها في 8% sucrose طوال الليل عند 4 °C.
   3. صب وسط التثبيت في قوالب تجميد بلاستيكية، وضع العينات داخل وسط التثبيت، مع التأكد من خلوها من فقاعات الهواء. أضف وسط التثبيت حتى يتم تغطية العينة جيدًا. خزّن العينات المدمجة عند -80 °C لحين الاستخدام.
   4. جهز مقاطع تجميدية (10 µm) باستخدام المقطاع بالتجميد (cryotome). قيم عملية إعادة التخليط الخلوي عن طريق التلوين بالهيماتوكسيلين + الإيوزين. قيم كفاءة التنصيص عن طريق التلوين المناعي الكيميائي النسيجي للجين المستهدف (في هذه الحالة: EmGFP).

النتائج

الشكل 1. مخطط للناقل AAV2/6 ذاتي التكملة وشبه النمطي المستخدم في هذه الدراسة.يتكون الجينوم من التكرارات الطرفية المعكوسة (ITR) لـ AAV2، ويشفر EmGFP تحت تحكم محفز CMV، بالإضافة إلى shRNA تحت تحكم محفز U6.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
Tissue-Tek O.C.T.	Weckert-Labortechnik	601
قالب تجميد 15 x 15 x 5 mm	Sakura	456
حضّانة	Fraunhofer	/