توليد خلايا ذات تثبيط جيني شرطي باستخدام نظام تعبير shRNA لفيروسي بطيء مستجيب للتتراسيكلين

الملخص

توليد خطوط خلوية محولة جينياً بشكل مستقر يتم استزراع خلايا سرطان القولون HCT116 وخلايا سرطان الثدي MDA-MB-231 بكثافة 50,000 خلية/بئر في وسط Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) المكمل بـ 10% مصل بقري جنيني (FBS) و1% بنسيلين/ستربتومايسين (Pen/Strep) في طبق يحتوي على 12 بئراً. تُحضن الخلايا عند درجة حرارة 37 درجة مئوية وبتركيز 5% من ثاني أكسيد الكربون (CO2) حتى تصل نسبة تلاقي الخلايا إلى 60 - 70%. تُغسل الخلايا بمحلول ملحي منظم بالفوسفات (PBS)، ثم يُضاف 1 مل من الوسط المحتوي على الفيروس إلى الخلايا السرطانية وتُحضن طوال الليل عند درجة حرارة 37 درجة مئوية وبتركيز 5% من ثاني أكسيد الكربون (CO2). وكعينة ضابطة، يُضاف 1 مل من وسط DMEM الطازج المكمل بـ 10% مصل بقري جنيني و1% بنسيلين/ستربتومايسين إلى بئرين تحتويان على خلايا سرطانية. يُزال الوسط المحتوي على الفيروس بعناية عن طريق الشفط. تُغسل الخلايا بمحلول PBS ويُستبدل الوسط بوسط DMEM يحتوي على 10% (حجم/حجم) مصل بقري جنيني خالٍ من التتراسيكلين (Tet-free FBS) و1% بنسيلين/ستربتومايسين. بعد 72 ساعة، تُغسل الخلايا بمحلول PBS ويُغير الوسط إلى DMEM يحتوي على 10% مصل بقري جنيني خالٍ من التتراسيكلين، و1% بنسيلين/ستربتومايسين، و1 ميكروجرام/مل من البوروميسين (puromycin) لاختيار الخلايا المحولة بالفيروس. بناءً على الخط الخلوي المستخدم، يتم ضبط تركيز البوروميسين لتحقيق الاختيار الأمثل عن طريق اختبار نطاق من تركيزات البوروميسين (0.1، 0.5، 1، 2، و5 ميكروجرام/مل) في خلايا غير محولة، واختيار أدنى تركيز لا تنجو عنده أي من الخلايا الضابطة بعد 3 أيام من الاستزراع. يتم اختيار الخلايا المحولة بالفيروس عن طريق استزراعها في وجود البوروميسين لمدة تتراوح بين 3 إلى 14 يوماً. وكعينات ضابطة، يتم تحضير بئرين إضافيين من الخلايا غير المحولة، أحدهما بوسط يحتوي على البوروميسين والآخر بدون بوروميسين. يُلاحظ القتل الجزئي للخلايا بواسطة البوروميسين في البئر الذي يحتوي على الخلايا المحولة بالفيروس مقارنة بالآبار الضابطة. ملاحظة: الخلايا غير المحولة لن تنمو في وجود البوروميسين. يتم التحقق من كفاءة التثبيط الشرطي (KD) في خلايا سرطان القولون HCT116 وخلايا سرطان الثدي MDA-MB-231 المقاومة للبوروميسين. ملاحظة: يختلف التركيز الفعال من الدوكسيسيكلين (doxycycline) باختلاف الخط الخلوي المستخدم ويجب معايرته (عادة من 100 نانوجرام/مل إلى 2 ميكروجرام/مل). يتم تحديد تركيز الدوكسيسيكلين الذي لا يسبب سمية للخلايا ولكنه فعال في تقليل تعبير البروتين المستهدف. في هذا البروتوكول، تم استخدام تركيز 1 ميكروجرام/مل بنجاح مختبرياً (in vitro). تُستزرع الخلايا لمدة 72 ساعة في وجود وغياب الدوكسيسيكلين بتركيزات 0.1 و1 و2 ميكروجرام/مل. يتم التحقق من مستوى تعبير البروتين المثبط (وهو هنا مثبط منشط البلازمينوجين 1 (PAI-1)) في مستخلص الخلايا عن طريق تحليل لطخة ويسترن (Western blot). تُقارن خلايا HCT116 وMDA-MB-231 التي تعبر شرطياً عن حمض ريبوزي نووي قصير الشكل (shRNA) بالخلايا الضابطة ذات التسلسل العشوائي (scrambled control cells). كوبالا، م. هـ. & دي كليرك، واي. إيه. التثبيط الشرطي للتعبير الجيني في خطوط الخلايا السرطانية لدراسة استقطاب الخلايا الوحيدة/الخلايا البلعمية إلى البيئة المجهرية للورم. مجلة التجارب المرئية (J. Vis. Exp.) (2017)

يوضح هذا الفيديو كيفية إنشاء خطوط خلايا سرطانية ذات تثبيط جيني مشروط باستخدام نظام shRNA فيروسي بطيء (lentiviral) محفز بواسطة التيتراسايكلن (Tet-inducible). كما يستعرض خطوات نقل الجينات الفيروسي، والاختيار باستخدام المضادات الحيوية، وإسكات الجينات المحفز بواسطة الدوكسيسيكلين.

البروتوكول

1. توليد خطوط خلوية محولة بشكل مستقر
   1. يتم استزراع خلايا سرطان القولون HCT116 وخلايا سرطان الثدي MDA-MB-231 بكثافة 50,000 خلية/بئر في وسط Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) مضاف إليه 10% مصل جنين البقر (FBS) و1% بنسيلين/ستريبتومايسين (Pen/Strep) في طبق يحتوي على 12 بئراً. تُحضن الخلايا عند 37 °C في جو يحتوي على 5% CO₂ حتى تصل درجة تلاقي الخلايا إلى 60 - 70%.
   2. تُغسل الخلايا بمحلول ملحي منظم بالفوسفات (PBS)، ويُضاف 1 mL من الوسط المحتوي على الفيروس إلى الخلايا السرطانية، ثم تُحضن طوال الليل عند 37 °C في جو يحتوي على 5% CO₂. وكعينة ضابطة، يُضاف 1 mL من وسط DMEM الطازج المضاف إليه 10% FBS و1% Pen/Strep إلى بئرين تحتويان على خلايا سرطانية.
   3. يُزال الوسط المحتوي على الفيروس بعناية عن طريق الشفط. تُغسل الخلايا بمحلول PBS ويُستبدل الوسط بوسط DMEM يحتوي على 10% (v/v) مصل جنين البقر الخالي من التتراسيكلين (Tet-free FBS) و1% Pen/Strep.
   4. بعد 72 h، تُغسل الخلايا بمحلول PBS ويُستبدل الوسط بوسط DMEM يحتوي على 10% Tet-free FBS و1% Pen/Strep و1 µg/mL من البوروميسين لاختيار الخلايا المحولة فيروسياً.
      1. بناءً على الخط الخلوي المستخدم، يتم ضبط تركيز البوروميسين لتحقيق الاختيار الأمثل عن طريق اختبار نطاق من تركيزات البوروميسين (0.1، 0.5، 1، 2، و5 µg/mL) في خلايا غير محولة، واختيار أدنى تركيز لا تنجو عنده أي من الخلايا الضابطة بعد 3 أيام من الاستزراع.
   5. يتم اختيار الخلايا المحولة فيروسياً عن طريق استزراع الخلايا في وجود البوروميسين لمدة تتراوح من 3 - 14 يوماً. وكعينات ضابطة، يتم تحضير بئرين إضافيين من الخلايا غير المحولة، أحدهما في وسط يحتوي على البوروميسين والآخر في وسط خالٍ منه. يُلاحظ القتل الجزئي للخلايا بواسطة البوروميسين في البئر الذي يحتوي على الخلايا المحولة فيروسياً مقارنة بالآبار الضابطة.
      ملاحظة: لن تنمو الخلايا غير المحولة في وجود البوروميسين.
   6. يتم التحقق من كفاءة التعطيل الشرطي (KD) في خلايا سرطان القولون HCT116 وخلايا سرطان الثدي MDA-MB-231 المقاومة للبوروميسين.
      ملاحظة: يختلف التركيز الفعال للدكسيسيكلين باختلاف الخط الخلوي المستخدم ويجب معايرته (عادةً من 100 ng/mL إلى 2 µg/mL).
      1. يتم تحديد تركيز الدوكسيسيكلين الذي لا يكون ساماً للخلايا ولكنه فعال في خفض تعبير البروتين المستهدف. في هذا البروتوكول، تم استخدام تركيز 1 µg/mL بنجاح في المختبر (in vitro).
      2. تُستزرع الخلايا لمدة 72 h في وجود وغياب الدوكسيسيكلين بتركيزات 0.1، 1، و2 µg/mL. يتم التحقق من مستوى تعبير البروتين الذي تم خفضه (في هذه الحالة، مثبط منشط البلازمينوجين 1 (PAI-1)) في مستخلص الخلايا عن طريق تحليل لطخة ويسترن (Western blot). تُقارن خلايا HCT116 وMDA-MB-231 التي تعبر شرطياً عن RNA قصير دبوس الشعر (shRNA) بالخلايا الضابطة ذات التسلسل العشوائي (scrambled control cells).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
ناقل lentiviral من نوع Tet-pLKO-puro	Addgene	21915
مصل جنين البقر (خالٍ من التتراسيكلين) FBS (Tetracycline-free)	Omega Scientific	FB-15
ناقل psPAX	Addgene	12260
ناقل pMD2.G	Addgene	12259
خلايا HEK293	ATCC	CRL-1573
محلول PBS	Corning	21-031-CV
وسط Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)	Corning	10-013-CV
محلول ملحي منظم بالفوسفات (PBS)	Corning	21-031-CV
حمض 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic (HEPES)	Sigma-Aldrich	H3375
بورومايسين Puromycin	Sigma-Aldrich	P9620
دوكسيسيكلين هيكلات Doxycycline hyclate	Sigma-Aldrich	D9891-25g
وسط معهد روزويل بارك التذكاري (RPMI)	Corning	10-040-CV
بنسلين-ستربتومايسين Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122