تحضير معلق مُغنى بالفيروسات باستخدام الطرد المركزي السكروزي المتدرج

الملخص

المصدر: Vijayraghavan, S. and Kantor, B. بروتوكول لإنتاج ناقلات فيروسية بطيئة (Lentiviral Vectors) ناقصة الإنزيم الدمجي من أجل تعطيل الجينات بوساطة CRISPR/Cas9 في الخلايا المنقسمة. J. Vis. Exp., (2017)

يوضح هذا الفيديو طريقة طرد مركزي فائق مكونة من خطوتين باستخدام تدرجات ووسائد السكروز لتنقية وتركيز الجسيمات الفيروسية من supernatant المزرعة الخلوية. تتيح هذه الإجراءات الفصل بناءً على الكثافة الطافية، مما يسمح باستعادة الفيروسات السليمة المناسبة للتطبيقات اللاحقة.

البروتوكول

1. تركيز الجسيمات الفيروسية عن طريق الطرد المركزي الفائق

ملاحظة: نحن نستخدم طريقة تنقية مزدوجة السكروز تتكون من خطوتين: خطوة تدرج السكروز وخطوة وسادة السكروز (الشكل 1).

1. قم بتعبئة أنابيب الطرد المركزي الفائق المخروطية بالترتيب التالي لإنشاء تدرج السكروز: 0.5 mL من السكروز بتركيز 70% (مذاب في محلول ملحي منظم بالفوسفات 1x [PBS])، و0.5 mL من السكروز بتركيز 60% (مذاب في DMEM)، و1 mL من السكروز بتركيز 30% (مذاب في وسط دولبيكو المعدل Eagle [DMEM])، و2 mL من السكروز بتركيز 20% (مذاب في 1x PBS).
2. أضف السائل الطافي الذي يحتوي على الفيروس بعناية إلى التدرج. وبما أن الحجم الإجمالي للسائل الطافي من أربعة أطباق بحجم 15 cm هو 100 mL، استخدم ستة أنابيب طرد مركزي فائق لكل دورة لمعالجة الحجم الكامل للسائل الطافي للفيروس.
   1. تصل سعة كل أنبوب طرد مركزي فائق مستخدم في هذه الخطوة إلى 30 mL (بما في ذلك حجم السكروز). وزع السائل الطافي الفيروسي بالتساوي بين الأنابيب، مع ترك مساحة فارغة لا تقل عن 10% لمنع الانسكاب.
   2. اضبط حجم المزرعة ليكون ~20 - 22 mL لكل طبق عند استخدام أكثر من أربعة أطباق بحجم 15 cm لكل تجربة، بحيث يمكن استيعاب الحجم النهائي المجمع للسائل الطافي الفيروسي بسهولة داخل ستة أنابيب طرد مركزي فائق.
   3. املأ أنابيب الطرد المركزي الفائق إلى ثلاثة أرباع سعتها الإجمالية على الأقل، وإلا فقد تحدث كسور في الأنابيب أثناء عملية الطرد المركزي، مما قد يؤدي إلى فقدان العينة و/أو تلف الجهاز.
3. وازن الأنابيب باستخدام 1x PBS واطرد العينات مركزياً عند 70,000 x g لمدة 2 h عند درجة حرارة 17 °C
   ملاحظة: لمنع اختلال طبقة السكروز أثناء التسارع، اضبط جهاز الطرد المركزي الفائق لتسريع الدوار ببطء حتى يصل إلى 200 rpm خلال أول 3 min من الدوران. وبالمثل، اضبط جهاز الطرد المركزي الفائق لتقليل سرعة الدوار ببطء من 200 rpm إلى 0 rpm على مدار 3 min في نهاية الدوران.
4. اجمع بعناية أجزاء السكروز بتركيز 30 - 60% في أنابيب نظيفة (الشكل 1). أضف 1x PBS بارداً إلى الأجزاء المجمعة وارفع الحجم إلى 100 mL؛ ثم اخلط عن طريق السحب والضخ بالماصة عدة مرات.
5. انتقل إلى خطوة وسادة السكروز عن طريق وضع التحضير الفيروسي بعناية في طبقات فوق وسادة سكروز. لهذا الغرض، أضف 4 mL من السكروز بتركيز 20% (في 1x PBS) إلى الأنبوب، يليه ~20 - 25 mL من المحلول الفيروسي لكل أنبوب. إذا كانت الأنابيب ممتلئة بأقل من ثلاثة أرباع سعتها، أكمل التعبئة باستخدام 1x PBS معقم.
6. وازن العينات بعناية واطردها مركزياً عند 70,000 x g لمدة 2 h عند درجة حرارة 17 °C، كما فعلت سابقاً. اسكب السائل الطافي واترك السائل المتبقي يتصرف عن طريق قلب الأنابيب على مناشف ورقية.
7. اشفط القطرات المتبقية لإزالة جميع السوائل من الراسب. في هذه الخطوة، يجب أن تكون الرواسب المحتوية على الفيروس مرئية بصعوبة كنقاط شفافة صغيرة.
8. أعد تعليق الرواسب بإضافة 70 µL من 1x PBS إلى الأنبوب الأول وخلط المعلق جيداً باستخدام الماصة، ثم انقل المعلق إلى الأنبوب التالي واخلطه كما سبق، واستمر في ذلك حتى يتم إعادة تعليق جميع الرواسب.
9. اشطف الأنابيب بـ 50 µL إضافية من 1x PBS البارد واخلط كما سبق. تأكد من أن الحجم الإجمالي للمعلق النهائي هو ~120 µL، وأن مظهره حليبي قليلاً؛ قم بتصفيته عن طريق الطرد المركزي عند 10,000 x g لمدة 30 s في جهاز طرد مركزي صغير لسطح المكتب.
10. انقل السائل الطافي إلى أنبوب طرد مركزي صغير جديد، وقسمه إلى حصص حجم كل منها 10 µL، وخزنها عند -80 °C.
    ملاحظة: تجنب إجراء دورات تجميد وإذابة متكررة على عينات الفيروسات البطيئة (lentiviral). وباستثناء الحالات التي يتطلب فيها الطرد المركزي، يجب بذل الجهود لتنفيذ الخطوات المتبقية في غطاءات زراعة الأنسجة أو غرف زراعة الأنسجة المخصصة باستخدام تدابير السلامة البيولوجية المناسبة.

النتائج

الشكل 1: تركيز الجسيمات الفيروسية باستخدام بروتوكول تدرج السكروز المزدوج. يتم تحميل الجسيمات الفيروسية التي جُمعت من السائل العلوي (SN) على تدرج السكروز. وتُستخدم محاليل سكروز بتركيزات 70% و60% و30% و20% لإنشاء هذا التدرج. وبعد عملية الطرد المركزي، يتم تحميل الجسيمات التي جُمعت من كسور السكروز بنسبة 30-60% على وسادة سكروز بتركيز 20% لترسيبها. وفي النهاية، يتم إعادة تعليق الراسب النهائي الذي يحتوي على الجسيمات الفيروسية المنقاة في 1x PBS لاستخدامها لاحقاً.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
المعدات
Optima XPN-80 Ultracentrifuge	Beckman Coulter	A99839
Allegra 25R tabletop centrifuge	Beckman Coulter	369434
أنابيب طرد مركزي فائقة ذات قاع مخروطي	Seton Scientific	5067
محولات الأنابيب المخروطية	Seton Scientific	PN 4230
SW32Ti swinging-bucket rotor	Beckman Coulter	369650
أنابيب طرد مركزي مخروطية بسعة 50mL	Corning	430291
ماصات زراعة الأنسجة، 25 mL	Corning	4489