تقدير عيار الفيروسات lentiviral باستخدام المقايسة المناعية المرتبطة بالإنزيم (ELISA)

الملخص

المصدر: Vijayraghavan, S., et al. بروتوكول لإنتاج نواقل فيروسية بطيئة (Lentiviral Vectors) ناقصة الإنزيم الدمجي من أجل تعطيل الجينات بوساطة CRISPR/Cas9 في الخلايا المنقسمة. J. Vis. Exp. (2017).

يوضح هذا الفيديو استخدام مقايسة ELISA لبروتين p24 لتقدير العيارات الفيروسية للنواقل الفيروسية البطيئة (lentiviral vectors). تتضمن المقايسة تحلل الجزيئات الفيروسية لتحرير p24، ثم التقاطه باستخدام أجسام مضادة نوعية، والكشف عنه بواسطة نظام مرتبط بإنزيم البيروكسيديز الذي ينتج تغيراً لونياً يمكن قياسه. ويتم تحديد كمية العيار الفيروسي من خلال مقارنة قيم الامتصاص للعينة بمنحنى قياسي.

البروتوكول

1. تقدير العيارات الفيروسية

1. طريقة المقايسة المناعية المرتبطة بالإنزيم (ELISA) لبروتين القفيصة p24 (فيروس نقص المناعة البشرية (HIV)-1 p24) ملحوظة: تُجرى المقايسة باستخدام أطباق ذات 96 بئراً عالية الارتباط وفقاً لإرشادات برنامج لقاح الإيدز التابع للمعاهد الوطنية للصحة (NIH AIDS Vaccine Program) الخاصة بطقم مقايسة التقاط مستضد HIV-1 p24 (راجع جدول المواد) مع إجراء بعض التعديلات.
   1. في اليوم التالي، اغسل الآبار ثلاث مرات باستخدام 20 µL من Tween 20 بتركيز 0.05% في محلول PBS بارد (محلول PBS-T). غطِّ الطبق بـ 10 µL من الجسم المضاد أحادي النسيلة anti-p24 بتخفيف 1:150 في 1x PBS، ثم حضنه طوال الليل عند 4 °C.
   2. للقضاء على الارتباط غير النوعي، قم بحجب الطبق باستخدام 20 µL من BSA بتركيز 1% في PBS؛ ثم اغسله ثلاث مرات باستخدام 20 µL من Tween 20 بتركيز 0.05% في محلول PBS بارد (محلول PBS-T) لمدة ساعة واحدة على الأقل في درجة حرارة الغرفة.
   3. تحضير العينات: بالنسبة لتحضيرات الناقلات المركزة، خف 1 µL من العينة بمقدار 10 ضعف عن طريق إضافة 89 µL من dd-H20 و 10 µL من Triton X-10 (التركيز النهائي 10%). أما بالنسبة للتحضيرات غير المركزة، فحضر عينات مخففة بمقدار عشرة أضعاف (أضف 80 µL من dd-H20 و 10 µL من Triton X-10 (التركيز النهائي 10%) إلى 10 µL من العينة). ملحوظة: يمكن تخزين العينات عند -20 °C في هذه الخطوة لفترة زمنية طويلة لاستخدامها لاحقاً.
   4. حضر معايير HIV-1 عن طريق إجراء تخفيف تسلسلي بمقدار ضعفين (بتركيز بدائي 5 ng/mL).
   5. خفف العينات المركزة (من المخزونات المخففة مسبقاً بنسبة 1:10) في وسط RPMI 1640 (وسط معهد روزويل بارك التذكاري 1640) المدعم بـ 0.2% Tween 20 و 1% BSA لعمل تخفيفات بنسبة 1:10,0 و 1:50,0 و 1:250,0. وخف العينات غير المركزة (من المخزونات المخففة مسبقاً بنسبة 1:10) في وسط RPMI 1640 المدعم بـ 0.2% Tween 20 و 1% BSA لعمل تخفيفات بنسبة 1:50 و 1:250 و 1:12,50.
   6. ضع العينات على الطبق في ثلاث مكررات وحضنها طوال الليل عند 4 °C.
   7. في اليوم التالي، اغسل الآبار ست مرات وحضنها عند 37 °C لمدة 4 h مع 10 µL من الجسم المضاد متعدد النسائل rabbit anti-p24، المخف بنسبة 1:10 في RPMI 1640، و 10% FBS، و 0.25% BSA، و 2% من مصل الفأر الطبيعي (NMS).
   8. اغسل ست مرات كما سبق وحضن عند 37 °C لمدة 1 h مع goat anti-rabbit horseradish peroxidase IgG المخف بنسبة 1:10,00 في RPMI 1640 المدعم بـ 5% من مصل الماعز الطبيعي، و 2% NMS، و 0.25% BSA، و 0.01% Tween 20.
   9. اغسل الطبق، كما سبق، وحضنه مع ركيزة بيروكسيديز TMB (3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine) في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 min.
   10. أوقف التفاعل بإضافة 10 µL من 1 N HCL. قم بقياس امتصاصية العينة عند 450 nm باستخدام قارئ امتصاصية الأطباق.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
كواشف مقايسة الممتز المنيعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) لبروتين p24
جسم مضاد أحادي النسيلة مضاد لبروتين p24	برنامج أبحاث الإيدز وكواشف المرجع التابعة للمعاهد الوطنية للصحة (NIH)	3537
معايير HIV-1	برنامج أبحاث وكواشف المراجع الخاص بمرض الإيدز التابع للمعاهد الوطنية للصحة (NIH)	SP968F
جسم مضاد أرنبي متعدد النسيلات مضاد لبروتين p24	برنامج أبحاث الإيدز وكواشف المراجع التابعة للمعاهد الوطنية للصحة	SP451T
جسم مضاد من الماعز ضد الأرنب من نوع IgG مرتبط ببيروكسيداز الفجل	Sigma Aldrich	12-348	تركيز العمل 1:150
مصل فأر طبيعي، معقم، 50 ملل	Equitech-Bio	SM30-050
مصل ماعز، معقم، 10 مل	سيجما	G9023	التركيز العامل 1:10
ركيزة بيروكسيداز TMB (3,3′,5,5′-تتراميثيل بنزيدين)	KPL	5120-0076	تركيز العمل 1:10,0