إنتاج الفيروس المرتبط بالغدة مأساوي المؤتلف عن طريق ترانسفكشن البلازميد

الملخص

1. ترنسفكشن خلايا HEK293 بـ بلازميدات الفيروس المرتبط بالغدة مأدنو المأشوب 9 (rAAV9) قم بتحضير محلول بولي إيثيلين إيمين (PEI) خطي بتركيز 1 ميكروجرام/ميكرولتر. أذب مسحوق PEI في ماء مقطر (dH2O) خالٍ من الإندوتوكسين تم تسخينه إلى 70-80 درجة مئوية. بعد التبريد إلى درجة حرارة الغرفة (RT)، قم بمعادلة المحلول إلى pH 7.0 باستخدام حمض الهيدروكلوريك (HCl) بتركيز 1 مولار. قم بتعقيم المحلول بالترشيح (0.22 ميكرومتر). قسم المحلول المخزون من PEI بتركيز 1 ميكروجرام/ميكرولتر إلى حصص (1,40 ميكرولتر/أنبوب) واحفظ المحلول عند -20 درجة مئوية. قم باستزراع خلايا HEK293 في وسط Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) مع 10% مصل جنين البقر (FBS) و1% بنسيلين/ستربتوميسين. استزرع الخلايا في حاضنة عند 37 درجة مئوية مع 5 ± 0.5% من ثاني أكسيد الكربون (CO2). في اليوم 0، قم بتوزيع خلايا HEK293 في عشرة أطباق بقطر 150 مم قبل 18-20 ساعة من عملية الترنسفكشن عن طريق تقسيم الخلايا التي وصلت درجة تلاقيها (confluence) إلى > 90% بتخفيف 1:2. ملاحظة: في اليوم 1، يجب أن تصل الخلايا إلى 90% من درجة التلاقي. في اليوم 1، قم بإجراء الترنسفكشن لخلايا HEK293 باستخدام بلازميد rAAV9 (على سبيل المثال، تركيبات rAAV9.cTNT::GFP أو rAAV6.U6::shRNA)، وبلازميد Ad-Helper، وبلازميد AAV-Rep/Cap باستخدام PEI. لعشرة أطباق من الخلايا عند درجة تلاقي 90%، اخلط 70 ميكروجرام من بلازميد AAV-Rep/Cap، و70 ميكروجرام من بلازميد rAAV9، و200 ميكروجرام من بلازميد Ad-Helper في أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل. إذا كانت درجة تلاقي الخلايا أقل، فقم بتعديل كمية الحمض النووي (DNA) بالتناسب. على سبيل المثال، إذا كانت الخلايا عند درجة تلاقي 75%، قلل كمية DNA بالتناسب (75/90 من الكمية الموضحة في الخطوة 1.4.1): اخلط 70 × 75/90 = 58.3 ميكروجرام من بلازميد AAV-Rep/Cap، و70 × 75/90 = 58.3 ميكروجرام من بلازميد rAAV9، و200 × 75/90 = 16.7 ميكروجرام من بلازميد Ad-Helper في أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل. أضف 49 مل من وسط DMEM بدرجة حرارة الغرفة (بدون FBS) إلى الأنبوب سعة 50 مل واخلط جيداً. أضف 1,360 ميكرولتر من محلول PEI لجعل نسبة PEI:DNA (حجم/وزن) هي 4:1. اخلط جيداً. حضن المزيج في درجة حرارة الغرفة لمدة 15-30 دقيقة. أضف 5 مل من المزيج الذي تم تحضيره في الخطوة 1.4.4 إلى كل طبق بقطر 150 مم (بإجمالي 50 مل من المزيج لعشرة أطباق بقطر 150 مم). استزرع الخلايا في حاضنة عند 37 درجة مئوية مع 5 ± 0.5% CO2 لمدة 60-72 ساعة. دينغ، ج.، وآخرونتحضير rAAV9 للإفراط في التعبير عن الجينات أو تثبيطها في قلوب الفئران. مجلة التجارب المرئية (J. Vis. Exp.) (2016)

يوضح هذا الفيديو إنتاج جسيمات الفيروس المرتبط بالغدة (adeno-associated virus) المؤتلف من خلال ترنسفكشن البلازميد في الخلايا الثديية. ويسلط الضوء على التعبير المنسق لبروتينات Rep وCap والبروتينات المساعدة التي تحفز تضاعف الجينوم الفيروسي وتجميع القفيصة داخل النواة.

البروتوكول

1. ترنسفكشن خلايا HEK293 باستخدام بلازميدات الفيروس المرتبط بالغدة الرئوية المؤتلف من النمط 9 (rAAV9)

1. حضّر محلول البولي إيثيلين إيمين (PEI) الخطي بتركيز 1 µg/µl. أذِب مسحوق PEI في ماء مقطر dH₂O خالٍ من السموم الداخلية تم تسخينه إلى 70-80 °C. بعد التبريد إلى درجة حرارة الغرفة RT، عادل المحلول حتى يصل إلى pH 7.0 باستخدام 1 M HCl. قم بتعقيم المحلول بالترشيح (0.22 µm). قسّم المحلول المخزون من PEI بتركيز 1 µg/µl إلى حصص (1,40 µl/أنبوب) واحفظ المحلول عند -20 °C.
2. ازرع خلايا HEK293 في وسط DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) مع 10% مصل جنين البقر (FBS) و1% بنسلين/ستربتومايسين. ازرع الخلايا في حضانة عند درجة حرارة 37 °C مع 5 ± 0.5% من ثاني أكسيد الكربون (CO₂).
3. في اليوم 0، وزع خلايا HEK293 في عشرة أطباق بقطر 150 مم قبل 18-20 ساعة من عملية التعداء (transfection)، وذلك بتقسيم الخلايا التي وصلت درجة تلاقيها إلى > 90% بتخفيف 1:2.
   ملاحظة: في اليوم 1، يجب أن تصل الخلايا إلى درجة تلاقٍ تبلغ 90%.
4. في اليوم 1، قم بتعداء خلايا HEK293 باستخدام بلازميد rAAV9 (على سبيل المثال، بنيات rAAV9.cTNT::GFP أو rAAV6.U6::shRNA)، وبلازميد Ad-Helper، وبلازميد AAV-Rep/Cap باستخدام PEI.
   1. بالنسبة لـ 10 أطباق من الخلايا عند درجة تلاقٍ 90%، اخلط 70 µg من بلازميد AAV-Rep/Cap، و70 µg من بلازميد rAAV9، و20 µg من بلازميد Ad-Helper في أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل.
   2. إذا كانت درجة تلاقي الخلايا أقل، اضبط كمية DNA بشكل تناسبي. على سبيل المثال، إذا كانت الخلايا عند درجة تلاقٍ 75%، قلل كمية DNA تناسبيًا (75/90 من الكمية المذكورة في الخطوة 1.4.1): اخلط 70 x 75/90 = 58.3 µg من بلازميد AAV-Rep/Cap، و70 x 75/90 = 58.3 µg من بلازميد rAAV9، و20 x 75/90 = 16.7 µg من بلازميد Ad-Helper في أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل.
   3. أضف 49 ml من وسط DMEM في درجة حرارة الغرفة RT (بدون FBS) إلى أنبوب الـ 50 مل واخلط جيداً.
   4. أضف 1,360 µl من محلول PEI لجعل نسبة PEI:DNA (حجم/وزن) هي 4:1. اخلط جيداً. حضّن في درجة حرارة الغرفة RT لمدة 15 - 30 دقيقة.
   5. أضف 5 ml من الخليط المُحضّر في الخطوة 1.4.4 إلى كل طبق 150 مم (إجمالي 50 ml من الخليط لعشرة أطباق 150 مم).
5. ازرع الخلايا في حضانة عند درجة حرارة 37 °C مع 5 ±0.5% CO₂ لمدة 60-72 ساعة.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
بولي إيثيلين إيمين، خطي (MW 25,0)	Polysciences, Inc.	#2396-2
أنبوب بولي بروبيلين، 36.2 ml، 25 x 87 mm، (الكمية 56)	Beckman Coulter, Inc	# 362183
وسط DMEM	Fisher Scientific	SH30243FS
مصل جنين البقر	Atlanta Biologicals	S150
ناقل rAAV9	Penn Vector Core	P1967