تنقية جزيئات الفيروس المعاد تركيبه من خلايا الكلى البشرية المنقولة جينياً

الملخص

المصدر: دينغ، ج. وآخرون، تحضير rAAV9 للإفراط في تعبير الجينات أو تثبيطها في قلوب الفئران. J. Vis. Exp. (2016)

يوضح هذا الفيديو تنقية جزيئات الفيروس المؤتلف من خلايا كلى بشرية محولة. يتم تحرير الفيروس عن طريق التحلل بالتجميد والذوبان، ثم تنقيته باستخدام تدرجات iodixanol مع الترشيح بمساعدة البوليمر المشترك الكتلوي.

البروتوكول

1. ترنسفكشن خلايا HEK293 ببلازميدات الفيروس المرتبط بالغدية المؤتلف من النمط 9 (rAAV9)
   1. حضّر محلول بولي إيثيلين إيمين (PEI) خطي بتركيز 1 µg/µl. أذب مسحوق PEI في dH₂O خالٍ من الإندوتوكسين مسخن إلى 70-80 °C. بعد التبريد إلى درجة حرارة الغرفة (RT)، عادل المحلول إلى pH 7.0 باستخدام حمض الهيدروكلوريك (HCl) بتركيز 1 M. قم بتعقيم المحلول بالترشيح (0.22 µm). قسم محلول PEI المخزون بتركيز 1 µg/µl إلى حصص (1,400 µl/أنبوب) واحفظ المحلول عند -20 °C.
   2. ازرع خلايا HEK293 في وسط Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) مع 10% مصل جنين البقر (FBS) و1% بنسيلين/ستربتوميسين. ازرع الخلايا في حاضنة عند 37 °C مع 5 ± 0.5% من ثاني أكسيد الكربون (CO₂).
   3. في اليوم 0، وزع خلايا HEK293 في عشرة أطباق قطرها 150 ملم قبل 18-20 ساعة من عملية الترنسفكشن، عن طريق تقسيم الخلايا ذات التلاقي (confluent) بنسبة > 90% بتخفيف 1:2.
      ملاحظة: في اليوم 1، يجب أن تصل الخلايا إلى نسبة تلاقٍ تبلغ 90%.
   4. في اليوم 1، قم بإجراء الترنسفكشن لخلايا HEK293 باستخدام بلازميد rAAV9 (على سبيل المثال، بنى rAAV9.cTNT::GFP أو rAAV6.U6::shRNA)، وبلازميد Ad-Helper، وبلازميد AAV-Rep/Cap باستخدام PEI.
      1. لعشرة أطباق من الخلايا بنسبة تلاقٍ 90%، اخلط 70 µg من بلازميد AAV-Rep/Cap، و70 µg من بلازميد pfrAAV9، و200 µg من بلازميد Ad-helper في أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل.
      2. إذا كانت نسبة تلاقٍ الخلايا أقل، عدل كمية DNA بشكل تناسبي. على سبيل المثال، إذا كانت الخلايا بنسبة تلاقٍ 75%، قلل كمية DNA تناسبياً (75/90 من الكمية الموضحة في الخطوة 2.4.1): اخلط 70 x 75/90 = 58.3 µg من بلازميد AAV-Rep/Cap، و70 x 75/90 = 58.3 µg من بلازميد rAAV9، و200 x 75/90 = 166.7 µg من بلازميد Ad-Helper في أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل.
      3. أضف 49 مل من DMEM بدرجة حرارة الغرفة (بدون FBS) إلى الأنبوب سعة 50 مل واخلط جيداً.
      4. أضف 1,360 µl من محلول PEI لجعل نسبة PEI: DNA (حجم/وزن) تبلغ 4:1. اخلط جيداً. حضن المزيج في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 - 30 دقيقة.
      5. أضف 5 مل من المزيج المحضر في الخطوة 1.4.4 إلى كل طبق بقطر 150 ملم (إجمالي 50 مل من المزيج لعشرة أطباق بقطر 150 ملم).
   5. ازرع الخلايا في حاضنة عند 37 °C مع 5 ±0.5% CO₂ لمدة 60-72 ساعة.
2. حصاد خلايا HEK293 المترنسفكتة وتنقية نواقل rAAV9
   1. احصد الخلايا بعد 60-72 ساعة من الترنسفكشن. قم بفصل وتعليق الخلايا في الأطباق عن طريق السحب والضخ بالماصة باستخدام وسط الزرع. انقل جميع معلقات الخلايا إلى أنابيب معقمة سعة 50 مل.
   2. قم بطرد الخلايا مركزياً عند 500 x g لمدة 5 دقائق. أعد تعليق كتلة الخلايا بـ 5 مل من المحلول الملحي المنظم بالفوسفات (PBS) في كل أنبوب واجمع كل معلقات الخلايا في أنبوب واحد سعة 50 مل.
   3. قم بطرد الخلايا مركزياً عند 500 x g لمدة 5 دقائق. تخلص من السائل الطافي. في هذه الخطوة، يمكن تخزين كتلة الخلايا عند -80 °C أو تنقية AAV فوراً من الكتلة، كما هو موضح في الخطوات 2.4-2.15.
   4. حضّر محلول التحلل (lysis buffer): 150 mM كلوريد الصوديوم (NaCl) و20 mM من ثلاثي هيدروكسي ميثيل أمينو ميثان هيدروكلوريد (Tris-HCl, pH 8.0). قم بتعقيمه بالترشيح (0.22 µM). احفظ المحلول المنظم عند 4 °C.
   5. أعد تعليق الكتلة باستخدام 10 مل من محلول التحلل.
   6. جمد ناتج التحلل عند -80 °C أو في حمام الثلج الجاف/الإيثانول، ثم أذب الجليد عند 37 °C. استخدم جهاز الفورتكس لمدة دقيقة واحدة. كرر عملية التجميد والإذابة لناتج التحلل 3 مرات.
   7. أضف محلول كلوريد المغنيسيوم (MgCl₂) إلى ناتج التحلل المذاب (اجعل التركيز النهائي لـ MgCl₂ في ناتج التحلل 1 mM). أضف النوكلياز ليكون التركيز النهائي 250 U/ml. حضن المزيج عند 37 °C لمدة 15 دقيقة لإذابة تجمعات DNA/البروتين.
      ملاحظة: إذا لم تذب تجمعات DNA/البروتين بعد المعالجة بالنوكلياز أو الإندونوكلياز، قم بتجانس نواتج التحلل باستخدام جهاز الدونس (dounce homogenizer) 20 مرة.
   8. قم بطرد العينة مركزياً عند 4,800 x g لمدة 20 دقيقة عند 4 °C. اجمع السائل الطافي.
   9. في هذه الأثناء، حضّر محلول تدرج Iodixanol:
      1. حضّر محلول التدرج بتركيز 17% عن طريق خلط 5 مل من 10x PBS، و0.05 مل من 1 M MgCl₂، و0.125 مل من 1 M كلوريد البوتاسيوم (KCl)، و10 مل من 5 M NaCl، و12.5 مل من وسط تدرج الكثافة. عدل الحجم الإجمالي إلى 50 مل باستخدام H₂O.
      2. حضّر المحلول بتركيز 25% عن طريق خلط 5 مل من 10x PBS، و0.05 مل من 1 M MgCl₂، و0.125 مل من 1 M KCl، و20 مل من وسط تدرج الكثافة، و0.2 مل من 0.5% (وزن/حجم) أحمر الفينول (Phenol Red). عدل الحجم الإجمالي إلى 50 مل باستخدام H₂O.
      3. حضّر المحلول بتركيز 40% عن طريق خلط 5 مل من 10x PBS، و0.05 مل من 1 M MgCl₂، و0.125 مل من 1 M KCl، و33.3 مل من وسط تدرج الكثافة. عدل الحجم الإجمالي إلى 50 مل باستخدام H₂O.
      4. حضّر المحلول بتركيز 60% عن طريق خلط 0.05 مل من 1 M MgCl₂، و0.125 مل من 1 M KCl، و50 مل من وسط تدرج الكثافة، و0.1 مل من 0.5% (وزن/حجم) أحمر الفينول.
   10. باستخدام إبرة وسرنجة، قم بتحميل محلول تدرج Iodixanol في أنبوب بولي بروبيلين بترتيب: 5 مل من تركيز 17%، ثم 5 مل من 25%، ثم 5 مل من 40%، وأخيراً 5 مل من 60%، بدءاً من القاع. حمّل كل ناتج التحلل الذي تم الحصول عليه من الخطوة 3.8 (14-16 مل) فوق التدرج. يكون التدرج، من الأسفل إلى الأعلى، هو 60%، 40%، 25%، 17%، ثم طبقة ناتج التحلل. املأ الأنبوب بمحلول التحلل وغطه بالسدادة.
   11. قم بالطرد المركزي عند 185,000 x g لمدة 90 دقيقة عند 16 °C.
   12. احصد الجزء الفيروسي (طبقة 40%) باستخدام سرنجة. أدخل الإبرة (قياس 21) في نقطة التقاء جزء 40% وجزء 60%، وقم بسحب طبقة 40% فقط.
       ملاحظة: تجنب سحب طبقة 25%.
   13. اخلط الجزء الفيروسي مع محلول PBS يحتوي على بوليوكسي إيثيلين-بوليوكسي بروبيلين بلوك كوبوليمر معقم (محلول مخزون من بوليوكسي إيثيلين-بوليوكسي بروبيلين بلوك كوبوليمر بتركيز 10% مخفف بنسبة 1:10,000 في PBS) حتى يصل الحجم الإجمالي إلى 15 مل. حمّل المزيج في أنبوب ترشيح (حد القطع للوزن الجزيئي MW = 100 kD). قم بالطرد المركزي عند 2,000 x g لمدة 30 دقيقة عند 4 °C.
   14. تخلص من المحلول الموجود في القاع. أعد ملء أنبوب الترشيح بمحلول بوليوكسي إيثيلين-بوليوكسي بروبيلين بلوك كوبوليمر PBS حتى يصل الحجم الإجمالي إلى 15 مل. قم بالطرد المركزي عند 2,000 x g لمدة 20 دقيقة عند 4 °C. كرر هذه الخطوة مرتين إضافيتين. اجمع فيروس rAAV9 المنقى (الجزء الموجود فوق المرشح).
   15. انقل rAAV9 المنقى من أنبوب الترشيح إلى أنابيب سعة 1.7 مل. قسم rAAV9 المنقى إلى حصص (100 - 400 µl/أنبوب، حسب الحجم وعيار AAV) واحفظ الفيروس عند -80 °C.
       ملاحظة: تجنب عمليات التجميد والإذابة المتكررة.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
بولي إيثيلين إيمين، خطي (الوزن الجزيئي 25,000)	Polysciences, Inc.	#23966-2
أنبوب، بولي بروبيلين، 36.2 مل، 25 × 87 مم، (الكمية: 56)	Beckman Coulter, Inc	# 362183
نوكلياز، فائق النقاء	SIGMA	#E8263-25KU
وسط تدرج الكثافة (يوديكسانول)	SIGMA	#D1556-250مل
وحدة ترشيح طرد مركزي بغشاء Ultracel-100	شركة EMD Millipore	#UFC910008
إبرة سحب مخبرية مع 90° نهايات غير حادة، مقياس 14، بطول 6 بوصات، محور مطلي بالنيكل	سيجما (SIGMA)	#CAD7942-12EA
محلول Poloxamer 188 (Pluronic® محلول F-68)	SIGMA	P5556-100ML
بروتيناز K	SIGMA	3115828001
دي إن آيز 1 (DNase I)	Roche	10104159001
جهاز طرد مركزي	Thermo Scientific	75004260
نظام طرد مركزي	Beckman Coulter	363118
جهاز طرد مركزي فائق السرعة	Beckman Coulter
وسط DMEM	Fisher Scientific	SH30243FS
مصل جنين البقر	Atlanta Biologicals	S11150
ناقل rAAV9	مركز بن للفيكتورات (Penn Vector Core)	P1967