نقل جينات E6 وE7 من فيروس الورم الحليمي إلى الخلايا البطانية (EC) ملاحظة: نستخدم بشكل روتيني دوارق زراعة الأنسجة القياسية لنمو الخلايا البطانية الأولية. ومع ذلك، إذا كان نمو الخلايا البطانية غير مرضٍ، فينبغي النظر في استخدام دوارق الزراعة التجارية. تُزرع الخلايا البطانية الأولية الجلدية الدقيقة أو اللمفاوية البشرية في حضانة رطبة عند 37 درجة مئوية مع 5% من ثاني أكسيد الكربون (CO2) في وسط نمو الخلايا البطانية (EGM؛ والذي يحتوي على الوسط الأساسي للخلايا البطانية [EBM] المكمل بـ EGM-2 BulletKit [الذي يحتوي على مصل جنين البقر، والهيدروكورتيزون، وعامل نمو الخلايا الليفية البشرية-B، وعامل نمو الخلايا البطانية الوعائية، وعامل النمو الشبيه بالإنسولين-1، وحمض الأسكوربيك، وعامل نمو الخلايا الظهارية البشرية، والمضادات الحيوية، والهيبارين]) في دورق زراعة خلايا T75 حتى تصل نسبة الالتحام إلى 50% تقريبًا. لإجراء عملية النقل، تُزرع خلايا PA317 LXSN 16E6E7 في حضانة رطبة عند 37 درجة مئوية مع 5% من ثاني أكسيد الكربون (CO2) في وسط Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) المكمل بـ 10% من مصل جنين البقر ومضادات الميكروبات في دورق زراعة خلايا T150 حتى تصل نسبة الالتحام إلى 90% تقريبًا. ثم تُحضن طوال الليل في 16 مل من الوسط الغذائي. يتم تصفية وسط PA317 عن طريق الطرد المركزي عند 300 × g لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. يُزال وسط EGM من مستنبت الخلايا البطانية، وتُغطى الخلايا بـ 12 مل من وسط PA317 المصفى وتُحضن لمدة 4 ساعات. ملاحظة: يؤدي طرد 16 مل من الوسط المكيف مركزياً عند 300 × g لمدة 5 دقائق إلى تكوين كريّة مدمجة لا تتأثر بالإزالة الحذرة لـ 12 مل من السائل الطافي المصفى لاحقاً. ومع ذلك، إذا كان هناك قلق من انتقال خلايا PA317 LXSN 16E6E7 إلى مستنبتات الخلايا البطانية الأولية (حيث إن خط خلايا التعبئة سينمو بسرعة متجاوزاً الخلايا البطانية)، فيمكن إجراء ترشيح للسائل الطافي المكيف عبر مرشح بمسامية 0.45 ميكرومتر قبل النقل. يُستبدل 6 مل من وسط PA317 بوسط EGM طازج وتُحضن الخلايا طوال الليل. تُغذى الخلايا البطانية مجدداً بـ 12 مل من وسط EGM طازج وتُحضن لمدة 48 ساعة إضافية. لإعادة استزراع الخلايا البطانية، يُزال الوسط وتُغسل الخلايا بـ 12 مل من المحلول الملحي المنظم بالفوسفات (PBS) الخالي من الكاتيونات، ويُضاف 3 مل من محلول تفكيك إنزيمي تجاري (مثل TrypLE) وتُحضن عند 37 درجة مئوية لمدة 3 دقائق. يُنقل معلق الخلايا إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل ويُطرد مركزياً عند 300 × g لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. تُعلق كريّة الخلايا الناتجة في وسط EGM طازج وتُقسم بالتساوي على 3 دوارق T75 بحجم نهائي قدره 12 مل من وسط EGM لكل دورق. لاختيار الخلايا البطانية التي تم نقل الجينات E6 وE7 إليها، يُضاف G418 بتركيز نهائي قدره 200 ميكروغرام/مل لمدة ممرين خلويين، وبعد ذلك يمكن زرع الخلايا البطانية المنقولة لغرض العدوى أو تجميدها في النيتروجين السائل. ماكاليستر، إس. سي.، هانسون، آر. إس.، وآخرون. نموذج مخبري لدراسة التحول الخلوي بواسطة فيروس هربس ساركوما كابوزي. مجلة التجارب المرئية (J. Vis. Exp).(2017)
يوضح هذا الفيديو عملية التنقيل الفيروسي الارتجاعي للخلايا البطانية الأولية باستخدام الجينات الورمية HPV16 E6/E7. وتعمل الجينات الورمية المدمجة على تثبيط كابحات الأورام p53 وRb، مما يؤدي إلى إطالة عمر الخلايا. ويساهم الاختيار باستخدام G418 في إثراء الخلايا المنقولة، مما ينتج عنه مستنبتات بطانية مخلدة مناسبة لدراسات التحول
