تحديد توزيع الحمض النووي الريبي (RNA) الفيروسي في الخلايا المضيفة عن طريق التهجين الموضعي المتألق (FISH)

الملخص

المصدر: Vallery, T. K. & Steitz, J. A. التهجين الموضعي الفلوري الكمي (FISH) والومضان المناعي (IF) لنواتج جينية محددة في الخلايا المصابة بفيروس KSHV. J. Vis. Exp. (2019)

يوضح هذا الفيديو تقنية التهجين الموضعي المتألق لتصوير الحمض النووي الريبوزي (RNA) الفيروسي في الخلايا المصابة بالفيروس. كما يستعرض الخطوات المتبعة في تهجين المسبار، وتضخيم الإشارة، والتصوير المجهري البؤري.

البروتوكول

1. تثبيت وتهجين وتصور الحمض النووي الريبي الفيروسي

1. أزل الوسط والخلايا الزائدة. طوال هذا البروتوكول، استخدم الشفط بالتفريغ لإزالة المحاليل، والماصة الدقيقة (micropipetting) بلطف لإضافة المحاليل.
   ملاحظة: يمكن تقليل قوة التفريغ بوضع طرف ماصة دقيقة سعة 20 µL فوق أنبوبة باستور الزجاجية. استبدل طرف الماصة الدقيقة بين خطوات الغسل لمنع التلوث. يجب تنفيذ كل خطوة غسل بسرعة لأنه من الضروري ألا تجف الخلايا أبداً.
2. قم بتثبيت الخلايا فوراً باستخدام 4% فورمالدهيد/PBS (محلول ملحي منظم بالفوسفات) مبرد مسبقاً على الثلج لمدة 30 دقيقة. اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام 20 µL من 1x PBS مبرد إلى 4 °C وحضنها لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة أو على الثلج.
   1. اجعل الخلايا المثبتة نفاذة باستخدام 20 µL من 0.5% Triton-X/PBS مبرد مسبقاً لمدة 10 دقائق على الثلج، أو 750 µL من الإيثانول بتركيز 70% مبرد مسبقاً عند 4 °C لمدة تتراوح من ساعة واحدة (كحد أدنى) إلى 7 أيام (كحد أقصى).
      ملاحظة: يتم إجراء جميع عمليات الغسل طوال هذا البروتوكول بنفس الطريقة ما لم ينص على خلاف ذلك. يعمل الإيثانول بتركيز 70% على إرخاء المادة اللاصقة بين الغرف والشريحة، مما يسهل عملية الفصل لاحقاً، كما يوفر وقفة زمنية كبيرة في البروتوكول. ومع ذلك، استخدم غشاء البارافين حول شريحة الغرف لتقليل التبخر وتحقق من مستوى الإيثانول في كل غرفة كل 8 ساعات تقريباً. كما يؤدي الإيثانول بتركيز 70% إلى تسطيح الخلايا، مما يعطي صورة أكثر وضوحاً، بينما لا يقوم Triton-X بتجفيف الخلايا أو تغيير أبعاد الخلية.
3. أزل الغرف بحذر لمنع تكسر الشريحة.
   ملاحظة: استخدم أداة إزالة جديدة أو أداة بها القليل جداً من المادة اللاصقة المتبقية المقدمة من الشركة المصنعة، وأزل الغرف بلطف لمنع تكسر الشريحة. إن استخدام الإيثانول بتركيز 70% ككاشف للنفاذية لمدة 4 ساعات يقلل بشكل كبير من احتمالية التكسر. في حالة حدوث كسر، استمر في البروتوكول على الغرف التي لم تتأثر بالكسر وكن مدركاً لمعدل الأكسدة الأعلى للشرائح غير المحكمة الإغلاق (أي نقص عمر التخزين).
4. اغسل الخلايا بـ 2x SSC (سترات صوديوم ملحية) مرة واحدة، ثم أضف 45 µL من محلول التهجين المكون من 50% فورماميد، و10% ديكستران سلفات، و2x SSC، و0.1% ألبومين المصل البقري (BSA)، و50 µg/mL من الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين (DNA) لنطاف سمك السلمون، و125 µg/mL من الحمض النووي الريبوزي الناقل (tRNA) لبكتيريا E. coli، و1 mM من معقدات فاناديل ريبونوكليوسيد. حضن العينات لمدة ساعة واحدة عند 37 °C في غرفة رطوبة، والتي يمكن أن تكون طبق بتري سعة 150 مم مع مساحات معقمة مبللة.
   ملاحظة: قم بتحضير محلول تهجين طازج قبل ساعة واحدة على الأقل من الاستخدام. أذب الديكستران سلفات في الماء أولاً، مع استخدام جهاز الرج (vortexing) بشكل متكرر والتحضين في حمام مائي عند 37 °C.
5. احسب كمية قليلة النوكليوتيدات (oligonucleotides) المطلوبة لتحقيق التركيز المقترح وهو 25 µM في 35 µL من محلول التهجين لكل غرفة. اضبط تركيز قليلة النوكليوتيدات المضادة للحس (anti-sense) حسب الحاجة. أضف الماء المقطر إلى قليلة النوكليوتيدات للوصول بحجم المسخ (denaturation) إلى 10 µL.
   ملاحظة: بعد تفاعل الوسم، تُخزن قليلة النوكليوتيدات في محلول الإخماد الذي يحتوي على 0.18 M كاكوديلات البوتاسيوم، و23 mM Tris-HCl، و0.23 mg/mL BSA، و4.5 mM CoCl₂، و18 mM حمض إيثيلين ديامين رباعي حمض الأسيتيك (EDTA)، و2.7 mM فوسفات البوتاسيوم، و6.8 mM KCl، و45 µM 2-Mercaptoethanol، و0.02% Triton X-10، و2% جليسيرول. التركيزات عالية بما يكفي بحيث أن التخفيف بالماء سيوصل محلول المسخ إلى تركيزات قريبة من 1x TE (أي 10 mM Tris-HCl و1 mM EDTA)، وهو منظم مسخ قياسي لقليلة النوكليوتيدات.
6. قم بمسخ قليلة النوكليوتيدات الموسومة بالديجوكسيجين (DIG) و/أو Alexa Fluor 594 عند 95 °C لمدة 5 دقائق. ثم أضف 35 µL من محلول التهجين الطازج لكل غرفة مستهدفة إلى قليلة النوكليوتيدات الممسوخة. في حالة إجراء تهجين موضعي فلوري مزدوج (FISH)، يمكن مسخ المجموعتين من قليلة النوكليوتيدات المضادة للحس وتهجينهما معاً.
7. أزل محلول ما قبل التهجين ثم أضف محلول التهجين الذي يحتوي على قليلة النوكليوتيدات الموسومة إلى الخلايا. حضن العينات طوال الليل في غرفة الرطوبة عند 37 °C مع استخدام رقائق القصدير لحماية قليلة النوكليوتيدات الموسومة بالفلوروفور.
   ملاحظة: يجب أن يكون التحضين لمدة 10 ساعات على الأقل ولا يزيد عن 24 ساعة.
8. في اليوم التالي، اغسل الخلايا مرتين بـ 2x SSC لمدة 10 دقائق عند 37 °C، ثم مرتين بـ 1x SSC لمدة 10 دقائق عند 25 °C.
9. ثبت الخلايا باستخدام 4% فورمالدهيد/1x PBS مبرد مسبقاً لمدة 10-15 دقيقة على الثلج. ثم اغسل الخلايا بـ PBS ثلاث مرات واجعلها نفاذة لمدة ساعة واحدة باستخدام إيثانول 70% مبرد مسبقاً أو لمدة 10 دقائق باستخدام 0.5% Triton-X/1x PBS مبرد مسبقاً عند 4 °C.
10. حضن الخلايا مع مضاد الديجوكسيجين (DIG)–إيزوثيوسيانات الفلوريسئين (FITC) بنسبة 1:20 في 0.1% BSA/1x PBS مبرد مسبقاً لمدة ساعة واحدة عند 4 °C. أزل محلول الأجسام المضادة واغسل ثلاث مرات بـ 1x PBS.
11. ثبت الخلايا باستخدام 4% فورمالدهيد/1x PBS مبرد مسبقاً لمدة 10-15 دقيقة عند 4 °C ثم اغسل ثلاث مرات بـ 1x PBS.
12. حضن الخلايا مع 0.4 µg/mL من 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) في 0.5% Triton-X/1x PBS مبرد مسبقاً لمدة 15 دقيقة على الثلج ثم اغسل ثلاث مرات بـ 1x PBS.
13. قم بتثبيت الشرائح مع حبيبات فلورية (اختياري) ووسط تثبيت. ثم أغلق غطاء الشريحة على الشريحة باستخدام طلاء أظافر شفاف.
14. باستخدام مجهر بؤري (confocal microscope)، اجمع صور العينات خلال فترة تتراوح من ساعة واحدة إلى أسبوع من تنفيذ البروتوكول بتكبير 630x. ضع طبقات متعددة من طلاء الأظافر لإغلاق غطاء الشريحة ولإطالة عمر الفلوروفور عن طريق تقليل معدل الأكسدة.
    ملاحظة: لا تستخدم وسط تثبيت يحتوي على DAPI. عند جمع الصور، أضف شريط المقياس (scale bar) على كل صورة للقياس الكمي لاحقاً. تعمل الحبيبات الفلورية كضوابط لشدة الفلورة بين الشرائح وتحضيرات العينات. التقط الصور من المقطع العرضي للخلية للقياس الكمي ثنائي الأبعاد (2D).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
Anti-DIG FITC	Jackson Lab Immunologicals	20-092-156
ديكستران سلفات	Sigma Aldrich	D8906	درجة البيولوجيا الجزيئية
طقم إضافة ذيول Oligonucleotide-DIG	Sigma Roche	#0353583910	الجيل الثاني
شرائح ثمانية الحجرات	Nunc Lab Tek II	#15453	يعز الختم الأزرق التوتر السطحي، ولكن يتوفر أيضاً الفصل بواسطة الجل الشفاف.
فورماميد	Sigma Aldrich	F9037	درجة البيولوجيا الجزيئية
معقدات فاناديل ريبونوكليوسيد	NEB	S1402S