قياس الحث التلقائي للعواقم في البكتيريا الحالة في بكتيريا ليزوجينية بمرور الوقت

الملخص

المصدر: Krishnamurthi, R., et al. فهم تأثير العاثيات المعتدلة على مستعمراتها الليزوجينية من خلال الترانسكريبتوميات. J. Vis. Exp. (2024).

يوضح هذا الفيديو التعداد الزمني للحث العفوي للعواقم في بكتيريا Pseudomonas aeruginosa المحولة ليزوجينياً، وذلك من خلال قياس الخلايا البكتيرية الحية (CFUs) وجسيمات العواقم المعدية (PFUs) بمرور الوقت. ومن خلال أخذ عينات في فترات زمنية محددة أثناء النمو وتحليل تكوين المستعمرات واللقاحات، تكشف هذه الطريقة عن الوقت الذي يكون فيه الحث العفوي في حده الأدنى. وهذا يتيح تحديد النقاط الزمنية المثلى لإجراء تحليل الترانسكريبتوم اللاحق مع تقليل التداخل الحليلي إلى أدنى حد.

البروتوكول

1. التعداد المباشر الزمني للحث التلقائي (الشكل 1)

1. قم بإعداد مستنبتات بادئة لليلة واحدة لكل من الليسوجين (على سبيل المثال، ليسوجين P. aeruginosa PAO1 الذي يحمل عاثيات LES (سلالة وباء ليفربول)) والمضيف المؤشر (PAO1-Rif^R) (Pseudomonas aeruginosa PAO1 المقاومة للريفامبيسين) عن طريق تلقيح مستعمرة واحدة في 5 mL من مرق LB (مرق لوريا-بيرتاني)، ثم احضنها عند 37 °C مع الرج بسرعة 180 rpm لمدة (18–24 h).
2. قم بإعداد مستنبتات حديثة لليسوجين والمضيف المؤشر عن طريق تلقيح المستنبتات المجهزة لليلة واحدة في 100 mL من مرق LB بنسبة 1:100، واحضنها عند 37 °C مع الرج (180 rpm).
   1. راقب نمو الليسوجين عن طريق قياس OD₆₀₀ والعدد الحي باستخدام تقنية Miles Misra. وللقيام بذلك، اجمع عينة بحجم 1 mL من كل مستنبت ليسوجين كل ساعة بدءاً من لحظة التلقيح ولمدة 8 h.
   2. قم بتخفيف العينة تسلسلياً فور جمعها عن طريق إضافة 100 µL من العينة إلى 900 µL من الوسط المناسب. استخدم جهاز Vortex جيداً بأقصى سرعة، وتخلص من الطرف عند كل تخفيف، واستمر في سلسلة التخفيف من 10⁻¹ إلى 10⁻⁹.
   3. ضع 10 µL من التخفيفات المطلوبة في ثلاث مكررات على طبق أغار LB، واتركها لتجف، ثم احضنها عند 37 °C لمدة 18–24 h.

   4. لحساب عدد الخلايا البكتيرية الحية، ابحث عن تخفيف يحتوي على مستعمرات يمكن عدها بسهولة. عُد عدد المستعمرات في كل بقعة، ثم استخدم الصيغة التالية:
       

      

      
      ملاحظة: مع نمو مستنبت الليسوجين، ستُنتج جزيئات عاثية نشطة عن طريق الحث التلقائي. إن إنتاج العاثيات المعدية يعني أن ترانسكريبتوم مجتمع الليسوجين قد تلوث الآن بالتعبير الجيني المرتبط بدورة التضاعف الحالة من إشارة تضاعف العاثية الحالة والاستجابة الخلوية المقابلة للمضيف. لذا، من المهم تحديد مرحلة النمو التي تكون فيها نسبة الخلايا الليسوجينية إلى جزيئات العاثيات المعدية الحرة هي الأعلى، وذلك للحد قدر الإمكان من ضوضاء النسخ الخلفية (الناتجة عن ترانسكريبتوم العاثية الحالة) في مجموعة البيانات.

3. لتعداد جزيئات العاثيات المعدية في كل عينة زمنية، لقّح 5 mL من أغار بكتيري معقم بتركيز 0.4% في مرق LB (أغار علوي) مع 100 µL من المضيف المؤشر في طور النمو الأسي المتوسط (OD600: 0.4–0.5؛ في هذه الحالة، PAO1-Rif^R) بوجود عامل انتقائي مناسب (50 µg·mL⁻¹ ريفامبيسين في هذه الحالة، حيث أن MIC للمضيف PAO1 هو 16 µg·mL⁻¹ فقط)
   1. ضع 10 µL من نفس التخفيف التسلسلي (انظر الخطوة 1.2.2) على طبقة الأغار العلوي الملقحة، واتركها لتجف قبل الحضن عند 37 °C لمدة 18–24 h.

   2. لحساب جزيئات العاثيات المعدية، ابحث عن تخفيف يحتوي على لويحات يمكن عدها بسهولة. عُد عدد اللويحات في كل بقعة.
       

      

   3. حدد الوقت/الظرف الذي يكون فيه الحث التلقائي لكل وحدة تشكيل مستعمرة (CFU) في حده الأدنى لاستخدامه في الخطوات التجريبية اللاحقة.

النتائج

الشكل 1: التصميم التجريبي لتعداد PFU و CFU لسلالة lysogen من العينة نفسها.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
PAO1		6
LESB58		6
LES phages	تم تحفيزها وتنقيتها من LESB58 باستخدام Norfloxacin.
مرق اللوسيجني (LB)	Merck	1.10285.500
آجار LB	Merck	1.10283.500
آجار آجار	Fisher	A/1080/53
الآجار العلوي	0.4 g آجار آجار + 2.5 g مرق LB في 100 mL ماء؛ يُعقم بالموصدة (autoclave) ثم يُستخدم.	-
ريفامبيسين	Sigma (المخزون: 50 mg/mL في الميثانول- يُمزج جيداً ويُستخدم مرشح 0.22µm للتعقيم ويُخزن في -20°C حتى الاستخدام)	R3501