تحفيز التضاعف التحللي للبروفاج من أجل التحليل الترانسكريبتومي

الملخص

المصدر: كريشنامورثي، ر.، وآخرونفهم تأثير العاثيات البكتيرية المعتدلة على الخلايا المدمجة من خلال تحليل النسخ. مجلة جو في إكس بي (J. Vis. Exp). (2024)

يوضح هذا الفيديو عملية تحفيز التضاعف التحليلي لـ prophage مدمج في الجينوم البكتيري، ورصد التغيرات في التعبير الجيني من خلال أخذ عينات في نقاط زمنية محددة لإجراء تحليل ترانسكريبتومي.

البروتوكول

1. تحضير مزارع الليسوجين غير المحفزة والمحفزة لاستخلاص الـ RNA (الحمض النووي الريبوزي)

1. قم بإعداد مزرعة ليلية جديدة عن طريق تلقيح مستعمرة واحدة من الليسوجين (lysogen) في 5 mL من وسط LB، واحضنها عند 37 °C مع الرج (180 rpm (دورة في الدقيقة)) لمدة 18-24 ساعة.
2. قم بإجراء استنبات فرعي للمزرعة الليلية في 80 mL من وسط LB (Lysogeny broth) بنسبة 1:100 في ثماني دوارق سعة 250 mL.
3. ضع ملصق "غير مستحث" (un-induced) على الدورق الأول، وملصق "مستحث" (induced) على الدوارق الأخرى، مع تحديد النقاط الزمنية التي يجب عندها جمع كل عينة (على سبيل المثال: "مستحث t = 0"، "مستحث t = 10 min"، "مستحث t = 20 min"، إلخ؛ (الشكل 1).
4. بعد 90 دقيقة من الحضن، عندما تتراوح قيمة OD (الكثافة الضوئية) 600 بين 0.1- 0.2، أو في وقت الحد الأدنى من الاستحثاث التلقائي (راجع المناقشة)، أضف 4 µL من حمض الخليك الثلجي بتركيز 1% (v/v) إلى الدورق غير المستحث (الشكل 1).
   ملاحظة: نظراً لأن العامل المستحث في هذا العمل تم تحضيره باستخدام حمض الخليك الثلجي بتركيز 1% كمذيب، فقد تمت إضافة نفس الكمية من المذيب بمفرده كخطوة ضبط. يمكن النظر في بدائل لضوابط الضبط اعتماداً على تحضير المحفزات المختلفة.
5. أضف المزرعة التي حجمها 80 mL من الدورق غير المستحث إلى 720 mL من وسط LB المعقم، وأضف على الفور محلول الإيقاف (فينول 5% [v/v] بارد جداً، pH 4.3، إيثانول 95% [v/v]) باستخدام حجم يمثل 20% من حجم المزرعة (160 mL)، واحضن المزيج على الثلج لمدة لا تقل عن 30 دقيقة ولا تزيد عن ساعتين لتثبيت نسخ RNA. هذه هي العينة غير المستحثة.
6. قم باستحثاث المزارع المتبقية في سبعة دوارق سعة 250 mL (الشكل 1) باستخدام FMIC (التركيز المثبط الأدنى النهائي) لعامل استحثاث مناسب (في هذه الحالة، 25 mg·mL−1 من النوروفلوكساسين norfloxacin، المحضر في حمض الخليك الثلجي بتركيز 1% [w/v]، والمستخدم بتركيز نهائي قدره 1 µg·mL−1)، ثم اخلط جيداً واحضن عند 37 °C مع الرج بسرعة 180 rpm لمدة ساعة واحدة.
   ملاحظة: ستجبر هذه الخطوة مزرعة الليسوجين على الدخول في حالة أكثر تنسيقاً من التضاعف الحالةحلولية (lytic replication). ستبدأ معظم الخلايا في المزرعة في الإنتاج الحالةحلولي لجزيئات العاثيات المعدية.
7. اترك الخلايا لتتعافى عن طريق إضافة 80 mL من المزرعة من الدورق المستحث إلى 720 mL من وسط LB المعقم، مما يؤدي فعلياً إلى تخفيف العامل المستحث. اجمع الخلايا البكتيرية من كل دورق كل 10 دقائق بدءاً من الزمن 0 وحتى ساعة واحدة عن طريق إضافة محلول الإيقاف، كما ذكر في الخطوة 1.5.
   ملاحظة: يعمل محلول الإيقاف على تثبيت RNA لمدة تصل إلى ساعتين. ومع ذلك، لتعزيز استقرار العينة، قم بإجراء جميع الخطوات اللاحقة عند 4 °C.
8. اجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 10,000 x g لمدة 15 دقيقة عند 4 °C في أسرع وقت ممكن، على ألا يتجاوز ذلك ساعتين بعد المعالجة لتجنب تحلل RNA.
9. تخلص من السائل الطافي، وأعد تعليق الكرات البكتيرية برفق في السائل المتبقي باستخدام ماصة أوتوماتيكية قابلة للتعديل قبل نقل كل عينة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق (microfuge tube) سعة 1.5 mL.
10. قم بطرد أنابيب الطرد المركزي الدقيقة بسرعة عالية (13,000 x g) في جهاز طرد مركزي دقيق عند 4 °C لمدة دقيقة واحدة، وتخلص من السائل الطافي المتبقي.
11. قم بالتجميد السريع للكرات عن طريق غمس كل أنبوب طرد مركزي دقيق مغلق في النيتروجين السائل؛ حيث يساعد ذلك في التحلل الفعال للخلايا من أجل استخلاص RNA.
12. أضف TRIzol (1 mL) إلى كل كرة مجمدة، وقم بتجانس المعلق عن طريق السحب بالماصة (تجنب استخدام جهاز الرج الدوامي vortex). احفظ العينات عند −80 °C حتى تصبح جاهزاً لإجراء استخلاص RNA لجميع العينات.
    ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتاً عند هذه النقطة.
13. كرر الخطوات 1.1-1.13 باستخدام ثلاث مكررات بيولوجية.

النتائج

الشكل 1: التصميم التجريبي لأخذ عينات من المزارع المُحفزة وغير المُحفزة لعزل الـ RNA.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
عاثيات LES	تم تحفيزها وتنقيتها من LESB58 باستخدام Norfloxacin.	هذه الدراسة
مرق Lysogeny (LB)	Merck	1.10285.500
آجار مرق Lysogeny (LB)	Merck	1.10283.500
آجار آجار	Fisher	A/1080/53
الآجار العلوي (Top Agar)	0.4 g آجار آجار + 2.5 g مرق LB في 100 mL ماء؛ يُعقم بالأتوكلاف ثم يُستخدم.	-
Rifampicin	Sigma (المحلول المخزون: 50 mg/mL في الميثانول- يُمزج جيداً ويُستخدم مرشح 0.22µm للتعقيم ويُخزن في درجة حرارة -20°C حتى الاستخدام)	R3501
حمض الخليك الثلجي	Fisher بنسبة 1% (v/v) في الماء	10060000
Norfloxacin	Sigma (المحلول المخزون: 25 mg/mL من حمض الخليك الثلجي بنسبة 1%- يُمزج جيداً ويُستخدم مرشح 0.22µm للتعقيم ويُخزن في درجة حرارة -20°C حتى الاستخدام؛ لتجنب دورات التجميد والإذابة، يُخزن في حصص صغيرة)	N9890
فينول مشبع بمحلول سترايت المنظم pH 4.3	Sigma	P-4682
إيثانول درجة البيولوجيا الجزيئية	Fisher	16695992
TRIzol	Invitrogen	12044977
كلوروفورم	Fisher	11398187
إيزوبروبانول	Fisher	17150576
ماء خالٍ من النيوكلييز	Invitrogen	10526945