حصاد الفيروس المرتبط بالغدة (AAV) من الخلايا الثديية المنقولة جينياً

الملخص

المصدر: رغي، أ. د.، وآخرونإنتاج ناقلات الفيروس المرتبط بالغدة (AAV) في مصفوفات خلوية للدراسات قبل السريرية في نماذج الحيوانات الكبيرة. مجلة التجارب المرئية (J. Vis. Exp.) (2021)

يوضح هذا الفيديو كيفية استعادة الفيروس المرتبط بالغدة (adeno-associated virus) الخام من خلايا ثديية منقولة باستخدام التحلل الكيميائي والطرد المركزي، مما يتيح إنتاج AAV بإنتاجية عالية لعمليات التنقية اللاحقة وتطبيقات العلاج الجيني قبل السريرية.

البروتوكول

1. حصاد AAV (الفيروس المرتبط بالغدة) والتحلل الكيميائي لخلايا HEK293 (كلية جنين بشرية 293) المنقولة جينياً

1. رج غرفة زراعة الخلايا بقوة لفصل الخلايا حتى يصبح الوسط عكراً بسبب الخلايا المنفصلة، ثم اسكبه في أربعة أنابيب طرد مركزي سعة 500 mL.
2. قم بإجراء الطرد المركزي للأنابيب عند 18,000 x g لمدة 30 min عند 4 °C لترسيب الخلايا. اسكب الطافي المصفى في زجاجة بولي إيثيلين تيريفثاليت كوبوليستر (PETG) سعة 1 L.ملاحظة: إذا لم يتوفر جهاز طرد مركزي عالي السرعة، يتم إجراء الطرد المركزي عند 12,000 x g لمدة 40 min. قد لا تكون الخلايا المترسبة متماسكة عند هذه السرعة وقد تنزلق أثناء سكب الطافي.
3. أعد تعليق رواسب الخلايا في أنابيب طرد مركزي سعة 500 mL باستخدام 50 mL من محلول التحلل (lysis buffer) وحضنها لمدة 60 min عند 37 °C.
4. قم بإجراء الطرد المركزي للأنابيب عند 18,000 x g لمدة 30 min، ثم انقل الطافي إلى زجاجة PETG سعة 1 L نفسها. تخلص من بقايا الخلايا المترسبة.ملاحظة: قم بتنقية الطافي المصفى فوراً واحفظه عند 4 °C لمدة تصل إلى 72 h. وللتخزين لفترات أطول، يحفظ عند -80 °C. لا تخزنه عند -20 °C.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
مجموعة زراعة خلايا ذات 10 غرف (Cellstack)	Corning	3271
زجاجة PETG سعة 1L	Thermo Fisher Scientific	2019-1000
وسط DMEM المعدل من دولبيكو (Dulbecco's Modified Eagle Medium) المحتوي على 1000 mg/L من D-glucose و L-glutamine	Cytiva Life Sciences	SH30022.01
مصل جنين البقر (FBS)	Thermo Fisher Scientific	SH30396.03
خلايا HEK293	American Tissue Culture Collection	CRL-1573	عند الاستلام، يتم إذابة الخلايا وزراعتها وفقاً لبروتوكول الشركة المصنعة. وبمجرد تمرير الخلايا بالحد الأدنى ونموها بشكل جيد، يتم تجميد جزء فرعي في حصص مستقبلية وتخزينها في النيتروجين السائل. يجب دائماً استخدام خلايا يقل عدد تمريراتها عن 30. وعندما يتم تمرير الخلايا المزروعة أكثر من 30 مرة، يوصى ببدء زراعة جديدة من الحصص المخزنة
وسادة دعم لأنابيب الطرد المركزي ذات الحجم الكبير	Corning	CLS431124	يجب استخدام وسادة الدعم مع أنابيب الطرد المركزي ذات الحجم الكبير ما لم يكن دوار جهاز الطرد المركزي مزوداً بوسائد ذات قاع على شكل V مناسبة
أنابيب طرد مركزي ذات حجم كبير	Corning	CLS431123-6EA	أنابيب طرد مركزي سعة 500 mL