تنقية ناقلات الفيروس المرتبط بالغدة باستخدام كروماتوغرافيا الألفة

الملخص

المصدر: Rghei, A. D., et al. إنتاج ناقلات الفيروس المرتبط بالغدّة في مصفوفات خلوية للدراسات قبل السريرية في نماذج الحيوانات الكبيرة. J. Vis. Exp. (2021)

يوضح الفيديو عملية تنقية ناقلات الفيروس المرتبط بالغدة (AAV) المؤتلف من محلل المضيف الخام باستخدام مصفوفة ألفة تعتمد على الهيبارين. ترتبط الجسيمات الفيروسية بالهيبارين المثبت، بينما يتم غسل الشوائب وإزالتها. ويقوم محلول منظم عالي الملوحة بتحرير الفيروسات السليمة، والتي تُجمع في أجزاء مخصبة. يتم بعد ذلك تركيز هذه الأجزاء عن طريق الطرد المركزي الغشائي وشطفها لاستعادة الجسيمات المتبقية، مما ينتج ناقلات AAV منقاة وذات عيار مرتفع.

البروتوكول

1. ترنسفكشن البلازميد المزدوج لخلايا HEK293 في مصفوفات الخلايا

1. قم بإذابة أنبوب تجميد يحتوي على خلايا كلية جنين الإنسان 293 (HEK293) في حمام خرز مضبوط عند 37 °C.
   ملاحظة: قم بتدفئة وسط Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) الكامل مسبقاً إلى 37 °C أثناء إذابة الخلايا لمنع الصدمة الباردة أثناء الزرع. تأكد من أن الخلايا ذات عدد ممر منخفض، ويفضل أن يكون أقل من 20، لضمان النمو الأمثل وكفاءة عفن الخلايا (transfection). تأكد من أن الخلايا معتمدة كخالية من الميكوبلازما.
2. انقل محتويات أنبوب التجميد قطرة بقطرة إلى أنبوب مخروطي سعة 15 mL يحتوي على 10 mL من وسط DMEM الكامل المدفأ مسبقاً، ثم قم بطرد الخلايا مركزياً عند 500 × g لمدة 5 min.
3. قم بشفط الوسط، ثم أعد تعليق خلايا HEK293 في 20 mL من وسط DMEM الكامل المدفأ مسبقاً. ازرع الخلايا في طبق سعة 15 cm وحضنها عند 37 °C، مع 5% CO₂.
4. قم بتقسيم الخلايا من طبق واحد سعة 15 cm إلى ثلاثة أطباق لزرعها في غرفة زراعة الخلايا.
   1. بمجرد وصول الخلايا إلى درجة تلاقي (confluency) بنسبة 80%، اشفط الوسط واغسل الطبق برفق باستخدام 3 mL من المحلول الملحي الموقوف بالفوسفات (PBS) لعدم تعطيل الطبقة الأحادية. بعد ذلك، اشفط PBS وأضف 3 mL من التريبسين (trypsin).
   2. حضن الطبق لمدة 2 min عند 37 °C حتى تنفصل الخلايا عن الطبق، ثم قم بمعادلة التريبسين بإضافة 7 mL من وسط DMEM الكامل إلى الطبق.
   3. اجمع كل الوسط والخلايا في أنبوب سعة 15 mL وقم بترسيب الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 500 × g لمدة 5 min.
   4. اشفط المادة الطافية من أنبوب الـ 15 mL وأعد تعليق راسب الخلايا في 3 mL من وسط DMEM الكامل. أضف 1 mL إلى كل طبق سعة 15 cm يحتوي على 20 mL من وسط DMEM الكامل؛ هز الأطباق برفق لتوزيع الخلايا بالتساوي، وحضنها عند 37 °C، مع 5% CO₂.
5. بمجرد وصول الخلايا إلى درجة تلاقي بنسبة 80%، كرر الخطوتين 1.4.1 و1.4.2. اجمع المادة الطافية في أنابيب مخروطية سعة 50 mL، واقلب الأنبوب برفق لضمان تجانس الخلايا.
6. حدد كثافة الخلايا عن طريق خلط 10 µL من عينات الخلايا مع 10 µL من صبغة تريبان الزرقاء (trypan blue) وإضافة الخليط إلى شريحة عد الخلايا لتحليلها في عداد الخلايا.
7. امزج 1 L من وسط DMEM الكامل المدفأ مسبقاً مع معلق الخلايا المطلوب لزرع غرفة زراعة الخلايا (مساحة سطح 6360 cm²) بكثافة 1 × 10⁴ cells/cm². صب خليط الخلايا في غرفة زراعة الخلايا وقم بتدويرها برفق لتوزيع الخلايا بالتساوي عبر كل طبقة أحادية (الشكل 1) وحضنها عند 37 °C، مع 5% CO₂.
8. بالإضافة إلى غرفة زراعة الخلايا، ازرع طبقاً سعة 15 cm بكثافة 1 × 10⁴ cells/cm² كمرجع لدرجة التلاقي.
9. بعد تحضين لمدة تقارب 65-h، افحص الطبق المرجعي للتأكد من درجة التلاقي- والتي يفضل أن تكون بين 80%-90%.
   ملاحظة: قم بتدفئة وسط DMEM الكامل مسبقاً إلى 37 °C قبل إضافته إلى غرفة زراعة الخلايا.
10. قم بتحضير خليط البولي إيثيلين إيمين (PEI)/DNA بنسبة تركيز 3:1 (وزن/وزن).
    1. حضّر خليط DNA في أنبوب مخروطي سعة 50 mL بإضافة 475 µg من pTrangene و1425 µg من pHelper إلى 40 mL من وسط مخفض المصل لإنشاء نسبة 3:1 من pHelper:pTrangene.
       ملاحظة: يمكن العثور على حاسبة خليط PEI/DNA باستخدام الجدول 1.

ترنسفكشن حجرة زراعة الخلايا
البروتوكول
1. اترك الـ DNA والـ OptiMEM والـ PEI لتصل إلى درجة حرارة الغرفة قبل عملية الترنسفكشن
2. أدخل عدد مجموعات الخلايا المراد عمل ترنسفكشن لها (لا يلزم إضافة كمية فائضة)
3. تأكد من صحة تركيزات الـ DNA لأن ذلك سيغير الأحجام المطلوبة
عدد حجرات زراعة الخلايا		1
تركيز بلازميد الجين المنقول		1	mg/mL
تركيز بلازميد pDGM6.2FF		1	mg/mL
		الكمية لكل حجرة زراعة خلايا		المزيج الرئيسي للترنسفكشن
	OptiMEM	48.1	mL	48.1	mL
نسبة 1:3 pTransgene:pHelper	pTransgene	475	µg	475	µL
	pHelper	1425	µg	1425	µL
4. أضف الأحجام المطلوبة من OptiMEM والـ plasmid DNA إلى أنبوب مخروطي سعة 50 mL
5. اقلب الأنبوب 10 مرات للمزج
نسبة 3:1 PEI:DNA	PEI Max	5.7	mL	5.7	mL
6. أضف الكمية المطلوبة من PEI إلى الأنبوب سعة 50 mL الذي يحتوي على OptiMEM والـ plasmid DNA
7. أغلق الأنبوب سعة 50 mL فوراً، واستخدم جهاز الفورتكس واقلب الأنبوب 3-5 مرات للمزج.
8. اضبط مؤقتاً لمدة 10 min لتحضين معقدات PEI
9. انقل مجموعات الخلايا المراد عمل ترنسفكشن لها إلى كابينة السلامة البيولوجية (BSC)
10. بعد مرور 10 min، صُب مزيج الترنسفكشن في فتحة برتقالية واحدة.
11. امزج السائل برفق في جميع أنحاء مجموعة الخلايا
12. أعد مجموعة الخلايا التي خضعت للترنسفكشن إلى الحاضنة مع ضمان توزيع حجم متساوٍ على كل طبقة
13. احصد حجرة زراعة الخلايا بعد 72 h

الجدول 1: حاسبة ترانسفكشن لغرفة استزراع الخلايا. ورقة عمل تفاعلية لتحديد التركيز الصحيح لكل من pTransgene وpHelper وPEI لعملية ترانسفكشن غرفة استزراع الخلايا.

2. أضف 5.7 mL من PEI (1 g/L) إلى الوسط الغذائي منخفض المصل ومزيج DNA قطرة بقطرة. بعد ذلك، استخدم جهاز الـ vortex لفترة وجيزة ثم حضن المزيج لمدة 10 min في درجة حرارة الغرفة.
ملاحظة: سيصبح مزيج PEI/DNA عكراً قليلاً أثناء التحضين في درجة حرارة الغرفة.

11. بعد حضانة PEI/DNA لمدة 8 دقائق، قم بإزالة الوسط من غرفة زراعة الخلايا.
    ملاحظة: تأكد من إرخاء كلا الغطاءين البرتقاليين للحفاظ على تدفق سلس للوسط لتجنب إزاحة الخلايا من مكانها.
12. أضف PEI/DNA إلى 1 L من وسط DMEM الكامل المسخن مسبقاً، وصب الخليط ببطء في منفذ غرفة زراعة الخلايا. وزع السائل بالتساوي على جميع الصفوف (الشكل 1) واحضنها لمدة 72 h عند 37 °C، مع 5% CO₂.

2 حصاد الفيروس المرتبط بالغدي (AAV) والتحلل الكيميائي لخلايا HEK293 المنقولة جينياً

1. رج غرفة زراعة الخلايا بقوة لفصل الخلايا حتى يظهر الوسط عكراً بسبب الخلايا المنفصلة، ثم صب المحتويات في أربعة أنابيب طرد مركزي سعة 500 mL.
2. قم بإجراء الطرد المركزي للأنابيب عند 18,000 × g لمدة 30 min عند 4 °C لترسيب الخلايا. صب الرائق المصفى في زجاجة بولي إيثيلين تيرفثالات كوبوليستر (PETG) سعة 1 L.
   ملاحظة: في حال عدم توفر جهاز طرد مركزي عالي السرعة، يتم إجراء الطرد المركزي عند 12,000 × g لمدة 40 min. قد لا تكون الخلايا المترسبة صلبة عند هذه السرعة، وقد تنزلق أثناء صب الرائق.
3. أعد تعليق رواسب الخلايا في أنابيب طرد مركزي سعة 500 mL باستخدام 50 mL من محلول التحلل (lysis buffer) واحضنها لمدة 60 min عند 37 °C.
4. قم بإجراء الطرد المركزي للأنابيب عند 18,000 × g لمدة 30 min، ثم انقل الرائق إلى زجاجة PETG سعة 1 L نفسها. تخلص من حطام الخلايا المترسب.
   ملاحظة: قم بتنقية الرائق المصفى فوراً، ويمكن تخزينه عند 4 °C لمدة تصل إلى 72 h. وللتخزين طويل الأمد، يُحفظ عند -80 °C. لا تخزنه عند -20 °C.

3 تنقية ناقل AAV باستخدام كروماتوغرافيا الألفة للهيبارين

1. أخرج المذيب الخام من درجة حرارة -80 °C واتركه في درجة حرارة 4 °C طوال الليل ليذوب. بمجرد ذوبانه، استخدم مرشحاً بمسامية 0.22 µM لترشيح المذيب الخام.
2. لخملنة جهاز التركيز بالطرد المركزي، أضف 4 mL من محلول التخزين المسبق للمرشح إلى جهاز التركيز بالطرد المركزي لكل عمود heparin sepharose مستخدم. قم بإجراء عملية الخملنة في درجة حرارة الغرفة لمدة تتراوح بين 2-8 h. قم بإعداد عملية الخملنة مباشرة قبل خطوات التنقية.
3. قم بتجهيز الأنابيب والمضخة (الشكل 2).
   1. ضع الأنابيب في مضخة 연دية ومرر 20 mL من 1 M NaOH. بعد ذلك، مرر 50 mL من مياه ذات درجة نقاوة جزيئية، ثم مرر 50 mL من وسط DMEM الأساسي.
   2. قم بتوصيل عمود heparin sepharose بسعة 5 mL بالأنابيب ومرر 25 mL من وسط DMEM الأساسي لإزالة المادة الحافظة.
4. مرر 0.2 µM من المذيب الخام المرشح عبر العمود بمعدل تدفق يتراوح بين 1-2 قطرة/ثانية.

ملاحظة: تأكد من عدم إدخال فقاعات هواء أو السماح بجفاف العمود، لأن ذلك سيؤدي إلى تلف العمود ويمنع استخلاص AAV. تخلص من العمود في حال جفافه واستخدم عموداً جديداً لبقية المحلول الخلوي الخام.

5. قم بتحميل كامل المادة المحللة الخام على عمود الهيبارين واستخدم المحاليل التالية لغسل العمود.
   1. اغسل باستخدام 50 mL من محلول هانكس الملحي المتوازن (HBSS) بتركيز 1× بدون Mg²⁺ و Ca²⁺.
   2. اغسل باستخدام 15 mL من N-Lauroylsarcosine بتركيز 0.5 % في HBSS بدون Mg²⁺ و Ca²⁺.
   3. اغسل باستخدام 50 mL من HBSS بدون Mg²⁺ و Ca²⁺.
   4. اغسل باستخدام 50 mL من HBSS مع Mg²⁺ و Ca²⁺
   5. اغسل باستخدام 50 mL من NaCl/HBSS بتركيز 200 mM مع Mg²⁺ و Ca²⁺.
   6. قم باستخلاص 5 × 5 mL (إجمالي 25 mL) باستخدام NaCl/HBSS بتركيز 300 mM مع Mg²⁺ و Ca²⁺ وقم بتسمية المستخلَصات من E1 إلى E5 (بحيث يكون كل مستخلَص بحجم 5 mL).
6. تركيز الفيروس باستخدام مركز طرد مركزي
   1. قم بتدوير المركز الطرد المركزي الذي يحتوي على محلول المعالجة المسبقة عند 900 × g لمدة 2 min. تخلص من السائل المار.
   2. اغسل مرشح المركز الطرد المركزي باستخدام 4 mL من HBSS مع Mg²⁺ و Ca²⁺ وقم بالطرد المركزي عند 1000 × g لمدة 2 min؛ ثم تخلص من السائل المار.
   3. أضف المستخلَص E2 إلى المركز الطرد المركزي. قم بالتدوير عند 1000 × g لمدة 5 min وتخلص من السائل المار.
   4. أكمل إضافة E2 ثم أضف E3 إلى المركز الطرد المركزي وقم بالتدوير عند 1000 × g لمدة 5 min حتى يصبح حجم الفيروس المركز حوالي 1 mL.
      ملاحظة: تجنب إجراء الطرد المركزي للناقل بحيث يصبح الحجم أقل من مستوى المرشح. لا تقم بتركيز E1 أو E4 أو E5 في المركز الطرد المركزي، لأنها تحتوي على كميات ضئيلة جداً من الناقل أو تخلو منه تماماً وتحتوي على ملوثات.
   5. انقل الفيروس المركز من المركز الطرد المركزي باستخدام رأس ماصة مُفلتر p200 وضعه في أنبوب طرد مركزي معقم سعة 1.5 mL.
   6. اشطف المركز الطرد المركزي باستخدام 200 µL من HBSS مع Mg²⁺ و Ca²⁺ لإزاحة أي AAV متبقٍ من المرشح. قم بالسحب والضخ بالماصة بقوة عدة مرات (لمدة ~30 s) لإزاحة أي فيروس ملتصق بالغشاء، ثم ضعه في أنبوب الطرد المركزي سعة 1.5 mL مع بقية الفيروس. اخلط الأنبوب جيداً.
   7. خذ عينة حجمها 5 µL لاستخلاص DNA وخزن الناقل المنقى عند -80 °C.
7. اغسل العمود باستخدام 25 mL من NaCl بتركيز 2 M. علاوة على ذلك، استخدم 25 mL من Triton X-100 بتركيز 0.1%، مُسخن مسبقاً إلى 37 °C لغسل العمود. بعد ذلك، اغسل العمود باستخدام 50 mL من dH₂O المعقم، ثم اغسله باستخدام 25 mL من الإيثانول بتركيز 20%.
8. تأكد من أن غشاء العمود مشبع تماماً بالإيثانول بتركيز 20%، حيث أن هذا هو محلول التخزين. أغلق العمود باستخدام السدادات المرفقة وخزنه عند 4 °C.
9. خزن الأنابيب في NaOH بتركيز 1 M.
   ملاحظة: إذا تم تنظيفها بشكل صحيح، يمكن إعادة استخدام أعمدة heparin sepharose حتى خمس مرات.

النتائج

الشكل 1: التعامل مع مكدس الخلايا من أجل استزراع الخلايا وترنسفكشنها.لبدء استزراع مكدس الخلايا، ابدأ بإزالة أحد أغطية التهوية وسكب 1 L من وسط Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) الكامل والمُدفأ مسبقاً مع الكمية المطلوبة من خلايا HEK293 (A). وزع الخلايا والوسط بالتساوي عن طريق إحكام إغلاق كلا غطائي التهوية وتجميع كل الوسط في زاوية مكدس الخلايا باستخدام أحد أغطية التهوية ووضعه في تلك الزاوية (B)، ثم ضع مكدس الخلايا على جانبه (C)، وبعد ذلك أدر مكدس الخلايا بزاوية 90° (D) بحيث تكون فتحات التهوية للأعلى (E). اخفض مكدس الخلايا برفق إلى وضعه الأفقي الطبيعي وتأكد من أن جميع حجرات مكدس الخلايا مغطاة بالكامل بالوسط (F). عند إجراء الترنسفكشن، قم بفك كلا غطائي التهوية واسكب الوسط القديم ببطء في حاوية نفايات معقمة لضمان تدفق متساوٍ لا يزعزع الطبقة الأحادية من الخلايا (G).

الشكل 2: إعداد المضخة 연دية (peristaltic pump) لتنقية الفيروس المرتبط بالغدّيات (AAV). يتم تمرير الأنابيب من المحلل الخام، عبر المضخة 연دية، وصولاً إلى عمود مصفوفة الهيبارين.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
مرشح 0.22 μm	Millipore Sigma	S2GPU05RE
تريبسين 0.25%	Fisher Scientific	SM2001C
مكدس خلايا بـ 10 غرف	Corning	3271
زجاجة PETG سعة 1L	Thermo Fisher Scientific	2019-1000
أطباق زراعة الخلايا	Greiner bio-one	7000232	أطباق 15 cm
أنبوب مخروطي للزراعة	Thermo Fisher Scientific	339650	أنبوب مخروطي 15 mL
أنبوب مخروطي للزراعة	Fisher Scientific	14955240	أنبوب مخروطي 50 mL
وسط DMEM (وسط إيجل المعدل من دلبيكو) مع 1000 mg/L من D-glucose وL-glutamine	Cytiva Life Sciences	SH30022.01
إيثانول	Greenfield	P016EA95	تخفيف الكحول الإيثيلي (95% vol) إلى 20% للقسم 3.7.4
مصل جنين البقر (FBS)	Thermo Fisher Scientific	SH30396.03
محلول هانك الملح المتوازن (HBSS) مع Mg²⁺ وCa²⁺	Thermo Fisher Scientific	SH302268.02
محلول هانك الملح المتوازن (HBSS) بدون Mg²⁺ وCa²⁺	Thermo Fisher Scientific	SH30588.02
خلايا HEK293	American Tissue Culture Collection	CRL-1573	عند الاستلام، قم بإذابة الخلايا وزراعتها كما هو موضح في بروتوكول الشركة المصنعة. وبمجرد تمرير الخلايا بالحد الأدنى ونموها بشكل جيد، قم بتجميد جزء فرعي في حصص مستقبلية وخزنها في النيتروجين السائل. استخدم دائماً خلايا يقل رقم تمريرها عن 30. وبمجرد تمرير الخلايا المزروعة أكثر من 30 مرة، يوصى بإعادة بدء الزراعة من الحصص المخزنة
عمود كبريتات الهيبارين	Cytiva Life Sciences	17040703
وسادة دعم أنابيب الطرد المركزي ذات الحجم الكبير	Corning	CLS431124	يجب استخدام وسادة الدعم مع أنابيب الطرد المركزي ذات الحجم الكبير ما لم يحتوي دوار الطرد المركزي على وسائد V-bottom المناسبة
أنابيب طرد مركزي ذات حجم كبير	Corning	CLS431123-6EA	أنابيب طرد مركزي 500 mL
أنبوب طرد مركزي دقيق	Fisher Scientific	05-408-129	أنبوب طرد مركزي دقيق 1.5 mL، يعقم قبل الاستخدام
ماء بدرجة نقاوة جزيئية	Cytiva Life Sciences	SH30538.03
ملح الصوديوم لـ N-Lauroylsarcosine	Sigma Aldrich	L5125	تنبيه. ارتدِ القفازات
NaCl	Thermo Fisher Scientific	BP35810
Optimem، وسط منخفض المصل	Thermo Fisher Scientific	31985070
ماصات باستور	Fisher Scientific	13-678-20D	تعقم قبل الاستخدام
محلول ملحي منظم بالفوسفات (10x)	Thermo Fisher Scientific	70011044	يخفف إلى 1x للاستخدام على الخلايا
محلول بنسيلين-ستربتوميسين	Cytiva Life Sciences	SV30010
بلازميد pHelper	تصميم جديد أو يتم الحصول عليه من مستودع البلازميدات	NA
حوض ماصات	Thermo Fisher Scientific	13-681-502	شراء أحواض ماصات معقمة
بولي إيثيلين جليكول تيرت-أوكتيل فينيل إيثر (Triton X-100)	Thermo Fisher Scientific	9002-93-1	تنبيه. ارتدِ القفازات
بولي إيثيلين إيمين (PEI)	Polyscience	24765-1	اتبع تعليمات الشركة المصنعة لتحضير محلول 1L. يتم الترشيح بمرشح 0.22μm والتخزين عند 4°C
بلازميد pTrangene	تصميم جديد أو يتم الحصول عليه من مستودع البلازميدات	NA	يجب أن يحتوي الجينوم على SV40 polyA ليكون متوافقاً مع معايرة AAV في القسم 5.0
أنابيب المضخة	Cole-Parmer	RK-96440-14	تحسين طول الأنابيب واحتواء الفيروس في الحصص E1-E5
هيدروكسيد الصوديوم (NaOH)	Thermo Fisher Scientific	SS266-4
أزرق تريبان	Bio-Rad	1450021