ترنسدكشن الأجنة المخصبة للجرذان باستخدام ناقلات فيروسية بطيئة (Lentiviral Vector)

الملخص

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تتضمن عينات حيوانية والموافقة عليها من قبل لجنة مراجعة أخلاقيات الحيوان المختصة. الحقن المجهري لناقلات الفيروسات البطيئة (lentiviral vectors) في أجنة في مرحلة الخلية الواحدة تحت المنطقة الشفافة (zona pellucida). ملاحظة: استخدم أجنة في مرحلة الخلية الواحدة مع وجود نواتين ظاهرتين للحقن المجهري (الشكل 1). قم بإذابة الجزء المخصص من الفيروس البطيء (LV) في درجة حرارة الغرفة، ثم قم بإجراء عملية طرد مركزي عند 10,00 x g وفي درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة دقيقتين لترسيب أي بقايا خلوية متبقية. إعداد جهاز الحقن المجهري قم بتجهيز ماصات التثبيت الزجاجية (شعيرية من زجاج البوروسيليكات) باستخدام الميكروفورج (microforge). اسحب الشعيرية الزجاجية فوق لهب لإنتاج طرف بطول 5-10 سم. اكسر الماصة بحيث يتبقى طرف بطول 4 سم تقريبًا. يجب أن يكون القطر الخارجي حوالي 80-120 ميكرومتر. ملاحظة: تأكد من أن طرف الماصة مستقيم وأملس تمامًا. قم بتجميع الماصة المسحوبة في الميكروفورج مع وضع الطرف أمام فتيل التسخين. سخّن الفتيل بالقرب جدًا من طرف الماصة واتركه يتقلص ليصل قطره إلى حوالي 15 ميكرومتر (حوالي 20% من حجم الجنين). ضع الماصة بشكل عمودي على فتيل التسخين، على بُعد 2-3 ملم من طرف الماصة، وابدأ بالتسخين. سيلين الزجاج؛ استمر في التسخين حتى يصل إلى زاوية 15 درجة. قم بتجهيز شعيريات زجاجية من البوروسيليكات للحقن المجهري باستخدام فتيل بواسطة جهاز سحب الماصات (pipette puller). أدخل الشعيرية في غرفة السحب. قم بإجراء اختبار المنحدر (للمرة الأولى عند استخدام زجاج جديد وفي كل مرة بعد تغيير الفتيل). اضبط الحرارة (Heat) على قيمة المنحدر ناقص 10، والسحب (Pull) على 10، والسرعة (Velocity) على 150، والزمن (Time) على 10. ملاحظة: قم بتعديل المعايير للحصول على شعيرية حقن مثالية. تحت غطاء تدفق صفائحي للسلامة الحيوية، قم بتحميل حوالي 2 ميكرولتر من المحلول الفيروسي في ماصة الحقن المجهري باستخدام طرف محمل مجهري (microloader tip). جهز طبق حقن مجهري (غطاء طبق بتري 60 ملم) بوضع قطرة بحجم 10 ميكرولتر من وسط M2 (في المنتصف)، مغطاة بالبارافين السائل أو الزيت المعدني. ثبّت ماصة التثبيت وشعيرية الحقن المجهري المحملة بالمحلول الفيروسي في جهاز التحكم المجهري (micromanipulator) وطبق الحقن المجهري تحت مجهر مقلوب. تنفيذ الحقن المجهري انقل 15-20 جنينًا في مرحلة الخلية الواحدة إلى قطرة M2 الموجودة في طبق الحقن المجهري. ثبّت الجنين باستخدام ماصة التثبيت. باستخدام تكبير 40x، احقن محلول الفيروس البطيء (LV) تحت المنطقة الشفافة في الحيز حول المح (perivitelline space) باستخدام الشعيرية الزجاجية المتصلة بحاقن آلي. ثبّت الشعيرية تحت المنطقة الشفافة للحظة. ملاحظة: باستخدام ضغط إيجابي خفيف، سيتدفق المحلول الفيروسي باستمرار من شعيرية الحقن، ولكن لا يمكن التحكم في حجم المعلق الذي يتم توصيله. باستخدام ماصة دقيقة، أعِد الأجنة إلى طبق الزرع في الحاضنة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية في جو يحتوي على 5% من ثاني أكسيد الكربون (CO2). قد يختلف عدد عمليات الحقن في الزيجوت الواحد، ويمكن تعديله بناءً على تركيز الناقل الفيروسي. ملاحظة: يمكن نقل الأجنة المحقونة إلى أمهات بديلة في مرحلة الخلية الواحدة، أو تحضينها طوال الليل (O/N) في وسط M16 قبل نقلها في مرحلة الخليتين. يجب تجنب الزراعة المطولة لأجنة الجرذان في المختبر (in vitro). كوزا، ب.، وآخرون. إنتاج جرذان معدلة وراثياً باستخدام نهج ناقلات الفيروسات lentiviral. مجلة التجارب المرئية (J. Vis. Exp.) (2020)

يوضح هذا الفيديو عملية إيصال النواقل اللينتيفيروسية (lentiviral vectors) إلى أجنة الجرذان المخصبة عن طريق الحقن المجهري لتحقيق دمج مستقر للجين المنقول من أجل توليد جرذان معدلة وراثياً.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تضمنت عينات حيوانية والموافقة عليها من قبل لجنة مراجعة أخلاقيات الحيوان المختصة.

1. الحقن المجهري للنواقل الفيروسية البطيئة في جنين في مرحلة الخلية الواحدة تحت المنطقة الشفافة
   ملحوظة: استخدم أجنة في المرحلة ذات الخلية الواحدة مع وجود نواتين أوليتين مرئيتين لعملية الحقن المجهري (الشكل 1).
   1. قم بإذابة الحصة المقسمة من الفيروس البطيء (LV) في درجة حرارة الغرفة، ثم قم بطردها مركزياً بسرعة 10,0 x g في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة دقيقتين لترسيب أي بقايا خلوية متبقية.
   2. إعداد الحقن المجهري
      1. قم بتحضير ماصات التثبيت الزجاجية (أنابيب زجاجية من البوروسيليكات) باستخدام جهاز الصهر الدقيق (microforge). اسحب الأنبوب الزجاجي فوق لهب لإنتاج طرف يتراوح طوله بين 5 و10 سم. اكسر الماصة بحيث يتبقى طرف بطول ~4 سم. يجب أن يكون القطر الخارجي حوالي 80-120 µm.
         ملاحظة: تأكد من أن طرف الماصة مستقيم تماماً وأملس.
      2. ثبّت الماصة المسحوبة في جهاز الصهر الدقيق (microforge) بحيث تكون الطرف أمام الفتيل التسخيني. سخّن الفتيل بالقرب جداً من طرف الماصة واتركه يتقلص حتى يصل قطره إلى ~15 µm (حوالي 20% من حجم الجنين). ضع الماصة بشكل عمودي على فتيل التسخين، على مسافة 2-3 مم من طرف الماصة، وابدأ بالتسخين. سيلين الزجاج. استمر في التسخين حتى يصل إلى زاوية 15° زاوية.
      3. جهز الشعيرات الزجاجية من البوروسيليكات الخاصة بالحقن المجهري باستخدام فتيلة وجهاز سحب الماصات. أدخل الشعيرة في غرفة السحب. قم بإجراء اختبار المنحدر (في المرة الأولى عند استخدام زجاج جديد، وفي كل مرة بعد تغيير الفتيلة). اضبط الحرارة (Heat) على قيمة المنحدر ناقص 10، والسحب (Pull) على 10، والسرعة (Velocity) على 150، والوقت (Time) على 10.
         ملاحظة: عدّل المعاملات للحصول على شعيرة حقن مثالية.
      4. تحت غطاء تدفق صفيحي للسلامة البيولوجية، يتم تحميل ما يقرب من 2 µL من المحلول الفيروسي في ماصة الحقن المجهري باستخدام رأس شاحن مجهري.
      5. جهّز طبق حقن مجهري (غطاء طبق بتري بقطر 60 مم) بـ 100 µL قطرة من وسط M2 (في المنتصف)، مغطاة بالبرافين السائل أو الزيت المعدني.
      6. ثبِّت ماصة التثبيت والأنبوب الشعري للحقن المجهري المحمل بالمحلول الفيروسي على مجهر تلاعب دقيق (micromanipulator) ووعاء الحقن المجهري تحت مجهر مقلوب.
   3. إجراء الحقن المجهري
      1. انقل ١٥-٢٠ جنيناً في مرحلة الخلية الواحدة إلى قطرة الوسط M2 الموجودة في طبق الحقن المجهري. ثبّت الجنين باستخدام ماصة تثبيت.
      2. باستخدام تكبير 400x، احقن محلول LV تحت المنطقة الشفافة (zona pellucida) في الحيز حول المحي (perivitelline space) باستخدام الشعيرة الزجاجية المتصلة بحاقن آلي. ثبّت الشعيرة تحت المنطقة الشفافة للحظة.
         ملاحظة: باستخدام ضغط إيجابي خفيف، سيتدفق المحلول الفيروسي باستمرار من الشعيرة الحقنية، ولكن لا يمكن التحكم في حجم المعلق الذي يتم حقنه.
      3. باستخدام ماصة دقيقة، أعد الأجنّة إلى طبق الزرع في الحاضنة عند 37 °C في جو يحتوي على 5% من ثاني أكسيد الكربون (CO2)₂ جو. قد يختلف عدد مرات حقن الزيجوت الواحد، ويمكن تعديله بناءً على تركيز الناقل الفيروسي.
         ملاحظة: يمكن نقل الأجنة المحقونة إلى أمهات بديلة في مرحلة الخلية الواحدة، أو تحضينها طوال الليل (O/N) في وسط M16 قبل نقلها في مرحلة الخليتين. ويجب تجنب الزرع المختبري المطول لأجنة الجرذان.

النتائج

الشكل 1. صورة مجهرية لجنين جرذ في مرحلة الخلية الواحدة تم تحضيره لحقن ناقل فيروسي لينتيويري تحت المنطقة الشفافة. تم تثبيت الجنين باستخدام ماصة تثبيت. يظهر في الصورة نواتان أوليتان تحتويان على المادة الوراثية الأمومية والأبوية، بالإضافة إلى الجسم القطبي. شريط المقياس = 20 μm.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
مجموعات أنابيب الشفط للماصات الشعيرية الدقيقة المعايرة	Sigma	A517-5EA
شعيرات زجاجية من بوروسيليكات مع فتيلة GC10TF-15	Harvard Apparatus Limited	30-039	شعيرة حقن
أطباق زراعة الأنسجة والخلايا CELLSTAR مقاس 35 ملم	Greiner Bio-One	627160
أطباق زراعة الأنسجة والخلايا CELLSTAR مقاس 60 ملم	Greiner Bio-One	628160
زيت معدني	Sigma	M8410-50ML
مجهر مقلوب	Zeiss	Axiovert 20
وسط M2	Sigma	M7167
VacuTip	Eppendorf	5175108	شعيرة تثبيت
وسط M16 EmbryoMax	Sigma	MR-016-D