تنقية الإنزيم الدمجي الفيروسي باستخدام كروماتوغرافيا الألفة

الملخص

المصدر: Lopez Jr., M. A., et al. الكشف عن تلوث النيوكلييز وإزالته أثناء تنقية إنزيم integrase لفيروس prototype foamy virus المؤتلف. J. Vis. Exp. (2017)

يوضح هذا الفيديو عملية تنقية إنزيم التكامل الفيروسي المسمى بـ polyhistidine-tagged باستخدام كروماطوغرافيا الألفة للنيكل. يستخدم البروتوكول شطفاً بتدرج الإيميدازول لعزل إنزيم التكامل انتقائياً بناءً على ألفته للراتنج المشحون بالنيكل.

البروتوكول

1. كروماتوغرافيا الألفة للنيكل

1. أذب قرصاً واحداً من الرواسب البكتيرية على الثلج.
   ملاحظة: سيستغرق ذلك وقتاً طويلاً (حوالي 2 - 3 ساعة). عندما يذوب القرص ويتحول إلى ملاط خلوي، أضف 500 μM إضافية من Phenylmethanesulfonyl Fluoride (PMSF) (محلول مخزون بتركيز 100 mM).
2. احتفظ بأنبوب سعة 50 mL من ملاط البكتيريا على الثلج. قم بتسليط الموجات فوق الصوتية (Sonication) على البكتيريا بسعة 30% لمدة 30 ثانية (ثانية واحدة تشغيل، ثانية واحدة إيقاف) لكل قرص مشتق من مزرعة سعة 1 L، باستخدام جهاز سونيكاتور مزود بقرن حيوي بقطر 0.5 بوصة ورأس مجهري مستدق بقطر 0.125 بوصة، وتردد 20 kHz وقدرة قصوى تبلغ 400 W.
3. انقل عينة الخلايا إلى أنبوب طرد مركزي فائق مبرد. استخدم مجموعات زجاجات البولي كربونات (قطر 25 mm، ارتفاع 89 mm) المتوافقة مع دوار الزاوية الثابتة من نوع Type 60 Ti. يمكن استخدام أنابيب ودوارات بديلة إذا تم تحقيق نفس قوة الجاذبية. قم بالتدوير بسرعة 120,000 x g لمدة 60 دقيقة عند 4 °C. يجب أن يتكون قرص واضح من الرواسب، وقد يظهر السائل الطافي بلون أصفر.
4. انقل السائل الطافي عن طريق السكب أو الماصة إلى أنبوب مخروطي مبرد سعة 50 mL. سجل الحجم؛ يجب أن يكون هذا الحجم تقريباً مساوياً لحجم محلول إعادة التعليق المستخدم قبل التجميد السريع. إذا كان السائل الطافي لزجاً، فقد يكون ملوثاً بالحمض النووي البكتيري الذي قد يسد عمود الكروماتوغرافيا. في هذه الحالة، كرر عملية الطرد المركزي الفائق لترسيب الحمض النووي البكتيري.
5. حضّر 500 mL من Buffer A (تركيز 50 mM Tris-HCl، pH 7.5، و500 mM NaCl، و500 μM PMSF) و500 mL من Buffer B (تركيز 50 mM Tris-HCl، pH 7.5، و500 mM NaCl، و500 μM PMSF، و200 mM imidazole).
   ملاحظة: في هذا البروتوكول، احتفظ بنظام الكروماتوغرافيا السائلة السريعة للبروتين (FPLC)، وجميع المحاليل المنظمة والعينة عند 4 °C في غرفة باردة.
   1. قم بترشيح المحلولين A وB تعقيماً باستخدام وحدات ترشيح قابلة للتخلص بمسامية 0.2 μm. وبناءً على نظام FPLC المستخدم، اغسل المضخة A والمضخة B باستخدام Buffer A وBuffer B على التوالي. مرّر 90% من Buffer A و10% من Buffer B عبر النظام حتى تستقر قراءات الموصلية والأشعة فوق البنفسجية (UV). سيعتمد معدل التدفق الأقصى على الجهاز؛ استخدم معدل تدفق 5 mL/min مع حد أقصى للضغط يبلغ 1.0 MPa.
6. حضّر عمود FPLC بطول 110 mm وقطر 5 mm يحتوي على 1.5 mL من الراتنج المشحون بالنيكل (سعة ربط قصوى 50 mg/mL، وضغط أقصى 1 MPa). يمكن تحضير العمود في اليوم السابق لعملية التنقية وتخزينه عند 4 ˚C.
7. وصّل العمود بجهاز FPLC. قم بموازنة العمود باستخدام 20 mL من 90% Buffer A و10% Buffer B (تركيز 20 mM imidazole) بمعدل تدفق 0.5 mL/min وحد أقصى للضغط يبلغ 0.5 MPa. يجب أن يقوم الجهاز بجمع بيانات لحظية للموصلية وامتصاص الأشعة فوق البنفسجية عند 280 nm (A₂₈₀). يجب أن تستقر قراءات الموصلية والأشعة فوق البنفسجية؛ وإذا لم تستقر هذه القراءات، استمر في تمرير المحاليل المنظمة عبر العمود حتى تستقر.
8. حمّل عينة البروتين (~10 mL لكل قرص) في العمود بمعدل تدفق 0.15 mL/min وحد أقصى للضغط يبلغ 0.5 MPa. يظل معدل التدفق وضغط العمود ثابتين طوال عملية التنقية. اجمع السائل النافذ في أنبوب سعة 50 mL.
   1. اغسل العمود باستخدام 20 mL من 90% Buffer A و10% Buffer B. اجمع ناتج الغسيل في أنبوب سعة 50 mL. استخلص البروتينات باستخدام تدرج خطي بحجم 20 mL من 10% إلى 100% من Buffer B (من 20 mM إلى 200 mM imidazole).
   2. أخيراً، اغسل العمود باستخدام 5 mL من 100% Buffer B (تركيز 200 mM imidazole). اجمع ناتج التدرج والغسيل النهائي في أجزاء سعة 0.27 mL.
9. اخلط 15 μL من محلول عينة 2x SDS-PAGE مع 15 μL من السائل النافذ، وناتج الغسيل، وأجزاء ذروة A₂₈₀. اغْلِ العينات لمدة 3 دقائق.
   1. حضّر جلي (gels) بنسبة 10% SDS-PAGE. حمّل 10 μL من كل عينة في الجلي و4 μL من معايير البروتين المصبوغة مسبقاً. قم بتشغيل الجلي وصبغها وتحليلها.
   2. اجمع الأجزاء التي تبدو أنها تحتوي على إنزيم prototype foamy virus integrase (PFV IN) نقي تقريباً بناءً على الفحص البصري. قم بقياس الحجم بواسطة الماصة، وعادة ما يكون بين 8 - 10 mL.
   3. باستخدام مقياس الطيف الضوئي، قم بقياس A₂₈₀ للأجزاء المجمعة واحسب الكمية الإجمالية لبروتين PFV IN؛ الحصيلة النموذجية هي ~10 mg لكل لتر من المزرعة المستحثة. معامل الانقراض لـ PFV IN مع وسم hexahistidine هو 59360 cm^-1 M^-1.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
BL21/DE3 Rosetta E. coli	EMD Millipore	70956-4
إيميدازول	Sigma-Aldrich	I0250
نيكل-نيتريلونتريك أسيتيك سوبر فلو (Ni-NTA Superflow)	Qiagen	30430