تنقية إنزيم الدمج الفيروسي باستخدام كروماتوغرافيا الألفة للهيبارين

الملخص

كروماتوغرافيا الألفة بالهيبارين قم بتحضير 250 مل من المنظم C (50 ملي مولار من هيدروكلوريد تريس(هيدروكسي ميثيل) أمين ميثان (Tris-HCl)، والرقم الهيدروجيني 7.5، و10 ملي مولار من ديثيوثريتول (DTT)، و0.1 ملي مولار من حمض إيثيلين ثنائي أمين رباعي الخليك (EDTA)، و500 ميكرومولار من فينيل ميثيل سلفونيل فلورايد (PMSF)) و250 مل من المنظم D (50 ملي مولار Tris-HCl، والرقم الهيدروجيني 7.5، و10 ملي مولار DTT، و0.1 ملي مولار EDTA، و500 ميكرومولار PMSF، و1 مولار NaCl). ملاحظة: في هذا البروتوكول، يتم الاحتفاظ بنظام الكروماتوغرافيا السائلة السريعة للبروتينات (FPLC) والمحاليل المنظمة والعينة في غرفة باردة عند درجة حرارة 4 مئوية. قم بترشيح المنظمين C وD تعقيمياً باستخدام وحدات ترشيح مخصصة للاستخدام مرة واحدة بمسامية 0.2 ميكرومتر. وبناءً على نظام FPLC المستخدم، اغسل المضخة A والمضخة B بالمنظم C والمنظم D على التوالي. مرر 80% من المنظم C و20% من المنظم D عبر النظام حتى تستقر قراءات الموصلية والأشعة فوق البنفسجية (UV). يعتمد الحد الأقصى لمعدل التدفق على الجهاز؛ ونحن نستخدم عادةً معدل تدفق قدره 5 مل/دقيقة مع حد أقصى للضغط يبلغ 1.0 ميجا باسكال. قم بتجهيز عمود FPLC بطول 80 ملم وقطر 5 ملم يحتوي على 1 مل من راتنج heparin Sepharose (سعة الارتباط القصوى 2.0 مجم من مضاد الثرومبين III البقري لكل مل من الراتنج؛ والضغط الأقصى 1.4 ميجا باسكال). يمكن تجهيز العمود في اليوم السابق لعملية التنقية وتخزينه عند درجة حرارة 4 مئوية. صِل العمود بجهاز FPLC. قم بموازنة العمود باستخدام 20 مل من 80% منظم C و20% منظم D (200 ملي مولار NaCl) بمعدل تدفق 0.5 مل/دقيقة مع حد أقصى للضغط يبلغ 1 ميجا باسكال. يجب أن يجمع الجهاز بيانات في الوقت الفعلي عن الموصلية وامتصاص الأشعة فوق البنفسجية عند 280 نانومتر (A280). يجب أن تستقر قراءات الموصلية والأشعة فوق البنفسجية، وإذا لم تستقر هذه القراءات، استمر في تمرير المحاليل المنظمة عبر العمود حتى تستقر. قلل تركيز NaCl في عينة إنتيجريز الفيروس الرغوي الأولي (PFV IN) إلى 200 ملي مولار بإضافة 1.5 حجم من المنظم C. على سبيل المثال، أضف 15 مل من المنظم C إلى 10 مل من PFV IN. عادةً ما يكون الحجم الإجمالي لدينا حوالي 25 مل. حمِّل عينة PFV IN المخففة على عمود heparin Sepharose بمعدل تدفق 0.5 مل/دقيقة مع حد أقصى للضغط يبلغ 1.0 ميجا باسكال. يظل معدل التدفق وضغط العمود ثابتين طوال عملية التنقية. اجمع السائل المار (flow-through) في أنبوب مخروطي سعة 50 مل. اغسل العمود بـ 20 مل من 80% منظم C و20% منظم D (200 ملي مولار NaCl)، مع جمع ناتج الغسل في أنبوب مخروطي سعة 50 مل. قم بشطف العمود باستخدام تدرج خطي بحجم 30 مل يتراوح من 20% إلى 100% من المنظم D (من 200 ملي مولار إلى 1 مولار NaCl). اغسل العمود بـ 5 مل من 100% منظم D. اجمع التدرج والغسلة النهائية في أجزاء بحجم 0.37 مل. حلل العينة المحملة، والسائل المار، وناتج الغسل، والأجزاء باستخدام الفصل الكهربائي للهلام بولي أكريلاميد-دوديسيل كبريتات الصوديوم (SDS-PAGE) بتركيز 8%. يمتلك PFV IN، بعد قطع وسم السداسي هيستيدين، وزناً جزيئياً قدره 44,394 دالتون، ويظل معامل الانقراض 59,360 سم-1 مولار-1 بدون وسم السداسي هيستيدين. خزن جميع الأجزاء عند درجة حرارة 4 مئوية حتى اكتمال مقايسة النيوكلياز. لوبيز الابن، م. وآخرونالكشف عن التلوث بالنوكلياز وإزالته أثناء تنقية إنزيم integrase الخاص بفيروس Prototype Foamy المأشوب. مجلة التجارب المرئية (J. Vis. Exp). (2017)

يوضح هذا الفيديو إجراء تنقية إنزيم التكامل الفيروسي من التلوث بالنوكلياز البكتيري باستخدام كروماتوغرافيا عمود heparin Sepharose، متبوعة بتحليل SDS-PAGE للتأكد من نقاء البروتين.

البروتوكول

1. كروماتوغرافيا الألفة للهيبارين
   1. حضّر 250 mL من المنظم C (50 mM tris(hydroxymethyl)aminomethane hydrochloride (Tris-HCl)، وpH 7.5، و10 mM dithiothreitol (DTT)، و0.1 mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)، و500 μM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)) و250 mL من المنظم D (50 mM Tris-HCl، وpH 7.5، و10 mM DTT، و0.1 mM EDTA، و500 μM PMSF، و1 M NaCl).
      ملاحظة: في هذا البروتوكول، يتم الاحتفاظ بنظام كروماتوغرافيا السوائل البروتينية السريعة (FPLC)، والمحاليل المنظمة، والعينة في غرفة باردة عند 4 ˚C.
      1. قم بترشيح المنظمين C وD تعقيميًا باستخدام وحدات ترشيح تستخدم لمرة واحدة بمسامية 0.2 μm. وبناءً على نظام FPLC المستخدم، اغسل المضخة A والمضخة B بالمنظم C والمنظم D، على التوالي. قم بتمرير 80% من المنظم C و20% من المنظم D عبر النظام حتى تستقر قراءات الموصلية والأشعة فوق البنفسجية (UV). سيعتمد الحد الأقصى لمعدل التدفق على الجهاز؛ ونحن نستخدم بشكل روتيني معدل تدفق قدره 5 mL/min مع حد أقصى للضغط يبلغ 1.0 MPa.
   2. حضّر عمود FPLC بطول 80 mm وقطر 5 mm يحتوي على 1 mL من راتنج heparin Sepharose (سعة الارتباط القصوى 2.0 mg من bovine antithrombin III لكل mL من الراتنج؛ والضغط الأقصى 1.4 MPa). يمكن تحضير العمود في اليوم السابق لعملية التنقية وتخزينه عند 4 °C. صِل العمود بجهاز FPLC.
      1. قم بموازنة العمود باستخدام 20 mL من 80% منظم C و20% منظم D (200 mM NaCl) بمعدل تدفق 0.5 mL/min وحد أقصى للضغط يبلغ 1 MPa. يجب أن يجمع الجهاز بيانات لحظية عن الموصلية وامتصاص الأشعة فوق البنفسجية عند 280 nm (A₂₈₀). يجب أن تستقر قراءات الموصلية والأشعة فوق البنفسجية. وإذا لم تستقر هذه القراءات، استمر في تمرير المحاليل المنظمة عبر العمود حتى تستقر.
   3. قلل تركيز NaCl في عينة إنترغريز الفيروس الرغوي النموذجي (PFV IN) إلى 200 mM بإضافة 1.5 حجم من المنظم C. على سبيل المثال، أضف 15 mL من المنظم C إلى 10 mL من PFV IN. عادة ما يكون الحجم الإجمالي لدينا ~25 mL.
   4. حمّل عينة PFV IN المخففة على عمود heparin Sepharose بمعدل تدفق 0.5 mL/min وحد أقصى للضغط يبلغ 1.0 MPa. يظل معدل التدفق وضغط العمود ثابتين طوال عملية التنقية. اجمع السائل النافذ في أنبوب مخروطي سعة 50 mL.
      1. اغسل العمود بـ 20 mL من 80% منظم C و20% منظم D (200 mM NaCl)، واجمع ناتج الغسيل في أنبوب مخروطي سعة 50 mL. قم بشطف العمود باستخدام تدرج خطي بحجم 30 mL من 20% إلى 100% من المنظم D (من 200 mM إلى 1 M NaCl).
      2. اغسل العمود بـ 5 mL من 100% منظم D. اجمع ناتج التدرج والغسيل النهائي في أجزاء حجم كل منها 0.37 mL.
   5. حلل العينة المحملة، والسائل النافذ، وناتج الغسيل، والأجزاء باستخدام الفصل الكهربائي للهلام بـ 8% sodium dodecyl sulfate–polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). يكون لـ PFV IN، بعد قطع وسم hexahistidine، وزن جزيئي قدره 44,394 Da، ويظل معامل الانقراض 59,360 cm^-1 M^-1 بدون وسم hexahistidine. خزن جميع الأجزاء عند 4 ˚C حتى اكتمال مقايسة النوكلياز.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
IPTG (إيزوبروبيل-β-D-1-ثيوجالاكتوبيرانوزيد β-D-1-ثيوجالاكتوبيرانوزيد)	دنفيل ساينتيفيك (Denville Scientific)	CI8280
تريس فائق النقاء (Tris Ultra Pure)	Gojira Fine Chemicals	UTS1003
كلوريد الصوديوم (NaCl)	P212121	RP-S23020
PMSF (فينيل ميثان سلفونيل فلوريد)	Amresco	754
ثنائي ثيوتريتول (DTT)	P212121	SV-DTT
إيديتات فائقة النقاء (UltraPure EDTA)	Invitrogen/Gibco	15575
هيبارين سيفاروز 6 التدفق السريع (Heparin Sepharose 6 Fast Flow)	جي إي هيلث كير لايف ساينسز (GE Healthcare Life Sciences)	17-0998-01