يصف هذا الفيديو مقايسة اللويحات الفيروسية باستخدام جسيمات فيروس كورونا الكاذب. يتم إضافة الفيروس الكاذب المخفف إلى طبقة أحادية من خلايا ثديية، يتبع ذلك الحضن مع طبقة تغطية من ميثيل السليلوز. تُعد اللويحات التي تشكلها الخلايا المصابة بصرياً لتحديد عيار الفيروس المعدي.
مقالة منهجية
تكميم جزيئات الفيروس الكاذب عن طريق مقايسة اللويحات
22 مشاهدة
⸱
سبتمبر 30, 2026
في هذه المقالة
الملخص
البروتوكول
تحديد عيار الفيروس الكاذب لفيروس التهاب الفم الحويصلي الذي يعبر عن بروتين السنبلة لفيروس كورونا والبروتين الفلوري الأخضر المعزز (VSV-S-eGFP)
1. التخفيف المتسلسل لتحديد العيار الفيروسي
1. يتم زرع خلايا Vero E6 في أطباق ذات 6 آبار بكثافة زرع تبلغ 6 × 105 خلية لكل بئر في وسط Dulbecco's Modified Eagle Medium أو DMEM (مع 10% FBS (مصل جنين البقر))، وتُحضن طوال الليل عند 37 °C مع 5% CO₂.
ملاحظة: يمكن أيضاً استخدام خلايا Vero التي تعبر عن TMPRSS2 و hACE2 بشكل مفرط.
2. قم بإعداد سلسلة تخفيفات تسلسلية بمقدار 10 أضعاف لفيروس VSV-SeGFP في وسط DMEM بارد وخالٍ من المصل، وذلك بوضع 900 μL من الوسط في سبعة أنابيب طرد مركزي دقيقة. قم بترقيم الأنابيب من 1 إلى 7. أضف 100 μL من المخزون الفيروسي إلى الأنبوب الأول وقم برجّه سريعاً باستخدام جهاز Vortex. انقل 100 μL من الفيروس المخفف من الأنبوب 1 إلى الأنبوب 2 وقم برجّه سريعاً؛ واستمر في هذه العملية حتى الأنبوب 7.
3. اسحب الوسط من جميع آبار لوحة الـ 6-well التي تحتوي على خلايا Vero E6، واستبدله بـ 500 μL من التخفيفات من 105 إلى 107. حضّن الألواح لمدة 45 min عند 37 °C مع 5% CO₂، مع رجّها برفق كل 15 min.
4. اسحب اللقاح واستبدله بطبقة تغطية تحتوي على خليط بنسبة 1:1 من 2x DMEM و6% carboxymethyl cellulose (CMC)، بتركيز نهائي 3% CMC، مضافاً إليه 10% FBS؛ ثم حضّن الصفائح عند 34 °C مع 5% CO₂ لمدة 48 h.
ملاحظة: قم بتدفئة خليط التغطية مسبقاً في حمام مائي عند 37 °C لمدة 15 min خلال خطوة العدوى. يمكن استخدام خليط بنسبة 1:1 من 1% agarose مع 2x DMEM مكمل بـ 10% FBS بدلاً من CMC. للتغطية باستخدام agarose، قم بغلي 1% agarose (في dH₂O) واخلطه مع 2x DMEM بارد. تأكد من وصول الخليط إلى درجة حرارة مناسبة قبل إضافته إلى الطبقة أحادية الخلايا (تقريباً 37-40 °C). في حال استخدام agarose للتغطية، يجب تثبيت الخلايا عن طريق تحضينها في 2 mL من 3:1 methanol:acetic acid لمدة ساعة واحدة على الأقل قبل التلوين.
2. الصبغ وحساب العيار الفيروسي
1. يتم تصور اللويحات عن طريق الصبغ بصبغة الكريستال البنفسجية أو التصور المباشر لـ eGFP تحت مجهر فلوري.
2. لصبغ الأطباق، يتم سحب طبقة التغطية، والغسل مرة واحدة باستخدام PBS، ثم إضافة 2 mL من الكريستال البنفسجي بتركيز 0.1% (في 80% ميثانول و dH₂O) إلى كل بئر. توضع الأطباق على هزاز الأطباق لمدة 20 min تقريباً في درجة حرارة الغرفة قبل إزالة الصبغة. يتم إزالة الكريستال البنفسجي، وغسل كل بئر برفق مرتين باستخدام dH₂O أو PBS.
ملاحظة: يجب تنفيذ خطوات الغسل والتلوين برفق عن طريق سحب السوائل ببطء نحو جانب كل بئر لضمان بقاء الطبقة الأحادية للخلايا سليمة طوال الإجراء.
3. تُترك الأطباق لتجف لمدة ساعة واحدة على الأقل قبل عد اللويحات. تأكد من الحصول على تعداد اللويحات من الآبار التي تحتوي على 20 إلى 200 لويحة. ولحساب عيار الفيروس بوحدات تشكيل اللويحات (PFU) لكل mL، اضرب معامل التخفيف للبئر الذي تم عده في حجم اللقاح، ثم اقسم عدد اللويحات الموجودة في البئر المعني على هذا الناتج.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 0.25% trypsin-EDTA (Gibco) | Fisher scientific | LS25200114 | |
| خلايا Vero E6 | ATCC | CRL-1586 | |
| كربوكسي ميثيل السليلوز | Sigma | C5678 | |
| وسط Dulbecco's modified Eagle's (Gibco) | Fisher scientific | 10-013-CV | |
| وسط Dulbecco's modified Eagle's (مسحوق) (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 12-800-017 | |
| محلول Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Fisher scientific | 21-031-CV | |
| بنسلين/ستريبتوميسين | Thermo Fisher Scientific | 15070063 | |
| الأجسام المضادة المعادلة لبروتين Spike لفيروس SARS-CoV-2 (2019-nCoV)، Mouse Mab | SinoBiological | 40592-MM57 |
