التعادل بوساطة الأجسام المضادة للفيروسات الكاذبة التي تعبر عن بروتين سنبلة فيروس كورونا باستخدام مصل المرضى

الملخص

المصدر: Jamieson, T. R., et al. الكشف عن الأجسام المضادة المعادلة لفيروس SARS-CoV-2 باستخدام التصوير الفلوري عالي الإنتاجية لعدوى الفيروسات الكاذبة. J. Vis. Exp. (2021)

يوضح هذا الفيديو عملية التعادل بوساطة الأجسام المضادة للفيروسات الكاذبة التي تحمل بروتينات سنبلة فيروس كورونا باستخدام مصل المرضى، والتي تمت دراستها من خلال التصوير الفلوري عالي الإنتاجية لطبقات أحادية من الخلايا الظهارية المصابة.

البروتوكول

تم تنفيذ جميع الإجراءات المتعلقة بجمع العينات وفقاً لإرشادات مجلس المراجعة المؤسسية (IRB) التابع للمعهد.

1. تخفيفات الأجسام المضادة أو المصل والعدوى

ملاحظة: يمكن تطبيق هذا البروتوكول لقياس تحييد الفيروس الكاذب من فيروس التهاب الفم الحويصلي الذي يعبر عن بروتين سبايك الخاص بفيروس كورونا والبروتين الفلوري الأخضر المحسن (VSV-S-eGFP)، وذلك باستخدام كل من الأجسام المضادة المتاحة تجارياً ومصل المرضى، بالإضافة إلى المصل الذي يتم جمعه من الحيوانات في دراسات تطوير اللقاحات قبل السريرية.

1. سلسلة التخفيفات المتسلسلة
   1. قبل تخفيف عينات المصل، قم بإبطال مفعول كل عينة حرارياً في حمام مائي بدرجة حرارة 56 °C لمدة 30 min لإبطال مفعول المتممة. تأكد من اتخاذ احتياطات السلامة اللازمة عند التعامل مع عينات المرضى؛ لا تفتح حاويات العينات إلا داخل غطاء زراعة الأنسجة، وتأكد من ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة للمستوى الثاني من الاحتواء.
   2. قم بإعداد سلسلة التخفيف في طبق فارغ مكون من 96 بئراً (Plate 1).
   3. ابدأ جميع التخفيفات في الصف A من الطبق المكون من 96 بئراً في حجم 80 µL. *بالنسبة لعينات المرضى، ابدأ سلسلة التخفيف بنسبة 1 إلى 10 عن طريق وضع 8 µL من المصل في 72 µL من وسط Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) الخالي من المصل (مع 1% penicillin/streptomycin).
      ملاحظة: سيعتمد تركيز الجسم المضاد المُحيّد المستخدم على النشاط المتوقع من الشركة المصنعة. بالنسبة للجسم المضاد المُحيّد لبروتين SARS-CoV-2 Spike المستخدم هنا (راجع جدول المواد)، ابدأ بتركيز 5 µg/mL لملاحظة تحييد بنسبة 50% على الأقل.
   4. أضف 40 µL من وسط DMEM الخالي من المصل (مع 1% penicillin/streptomycin) إلى الصفوف من B إلى G، و80 µL إلى الصف H. لا تضف الفيروس إلى الصف H، حيث يعمل كعنصر تحكم للخلايا فقط.
   5. باستخدام ماصة متعددة القنوات ذات 12 قناة، امزج وانقل 40 µL من المصل المخفف أو الجسم المضاد من الصف A إلى الصف B. امزج وكرر العملية حتى الصف F، ثم تخلص من 40 µL من الصف F. لا تضف المصل إلى الصف G لأنه يمثل صف عنصر التحكم للفيروس فقط.
2. العدوى والطبقة العازلة
   1. قم بتحضير حجم مناسب من VSV-S-eGFP المخفف لمعاملة كل بئر عند تعددية عدوى (MOI) تبلغ 0.05 (أو 2000 وحدة تكوين لويحة (pfu)). (عند إجراء هذه الحسبة، ضع في اعتبارك أنه سيتم نقل 60 µL فقط من إجمالي حجم 80 µL إلى الخلايا؛ لذا، تأكد من ضرب حجم الفيروس في 1.33 للحفاظ على 2000 pfu).
      ملاحظة: بما أن VSV-S-eGFP حساس للحرارة، تأكد من بقاء المخزونات الفيروسية على الثلج في حال عدم استخدامها، وتجنب دورات التجميد والإذابة المتكررة لأن العيارات ستختلف بعد التجميد المتكرر.
   2. أضف 40 µL من الفيروس المخفف إلى كل بئر في الصفوف من A إلى G في Plate 1 وامزج عن طريق السحب والضخ بالماصة 4-5 مرات. قم بتحضين الطبق لمدة 1 h عند 37 °C مع 5% CO₂.
   3. أخرج الطبق الذي يحتوي على الخلايا من المحضنة (Plate 2)، وقم بشفط الوسط بدقة من جميع الآبار. انقل 60 µL من خليط الجسم المضاد/الفيروس من Plate 1 إلى Plate 2، وحضنه لمدة 1 h عند 37 °C مع 5% CO₂، مع هز الطبق كل 20 min.
   4. أكمل ملء كل بئر بـ 140 µL من الطبقة العازلة التي تحتوي على carboxymethyl cellulose (CMC) في DMEM بتركيز نهائي 3% CMC (مع 10% FBS (مصل بقري جنيني) و1% penicillin/streptomycin). ضع Plate 2 في محضنة مضبوطة على 34 °C مع 5% CO₂ لمدة 24 h تقريباً قبل التصوير.
      ملاحظة: قم بتدفئة خليط الطبقة العازلة مسبقاً في حمام مائي بدرجة حرارة 37 °C لمدة 15 min خلال خطوة العدوى.

2. التصوير والتقدير الكمي (اليوم 3)

1. صوّر الأطباق باستخدام جهاز تصوير فلوري آلي (باستخدام مرشح إيزوثيوسيانات الفلوريسين (FITC) أو مرشح بديل بطول موجي للإثارة يبلغ 488 nm). قم بقياس العدوى الفيروسية من خلال إنشاء بروتوكول يحدد ويعد بؤر البروتين الفلوري الأخضر المعزز (eGFP) الفردية تلقائياً. في حال عدم توفر ميزة العد التلقائي، استخدم برنامج ImageJ لقياس عدد بؤر eGFP.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
كربوكسي ميثيل السليلوز	Sigma	C5678
وسط دولبيكو المعدل إيجل (Gibco)	Fisher scientific	10-013-CV
وسط دولبيكو المعدل إيجل (مسحوق) (Gibco)	Thermo Fisher Scientific	12-800-017
خلايا Vero E6	ATCC	CRL-1586
محلول دولبيكو المنظم بالفوسفات (DPBS)	Fisher scientific	21-031-CV