رصد التعبير الجيني الخاص بمراحل محددة في فيروس الجدري (Vaccinia Virus) باستخدام المراسلات الفلورية

الملخص

1. زراعة الخلايا قم بفصل خلايا HeLa من الطبق وتخفيفها في وسط نمو (وسط Dulbecco's Modified Eagle Medium [DMEM]، و2 ملي مولار من L-glut، و10% مصل جنين البقري [FBS]) لتصل الكثافة إلى 2.0 × 10^5 خلية/مل تقريباً. وزع 100 ميكرولتر/بئر في طبق ذو 96 بئراً، بجدران سوداء وقاع مسطح شفاف (20,000 خلية/بئر). حضّن الخلايا لمدة 24 ساعة حتى تبلغ مرحلة الالتحام في حاضنة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية + 5% ثاني أكسيد الكربون (CO2). 2. عدوى الخلايا قم بتخفيف الفيروسات وإصابة الخلايا. قم بإذابة الفيروس الفلوري TrpV (فيروس ثلاثي؛ Venus مبكر، mCherry وسيط، TagBFP متأخر) وPLV (Venus بدون محفز) وقم بتفكيك التجمعات باستخدام الموجات فوق الصوتية لمدة 5 دقائق. بدلاً من ذلك، يمكن خلط مخزونات الفيروس الخام بنسبة 1:1 مع تريبسين بتركيز 0.25 مجم/مل في وسط العدوى وتحضينها عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. خفف مخزونات الفيروس الخام في وسط عدوى عند 37 درجة مئوية (DMEM، و2 ملي مولار L-glut، و2% FBS). بالنسبة للعدوى ذات تعددية العدوى العالية (MOI) (10 PFU/خلية)، خفف مخزون الفيروس إلى 1.0 × 10^7 PFU/مل بافتراض وجود 5 × 10^4 خلية/بئر وحجم لقاح قدره 50 ميكرولتر. خطط لإصابة 3 آبار مكررة لكل معاملة باستخدام TrpV و3 آبار مكررة أخرى لنفس المعاملة باستخدام PLV لحساب الفلورة الخلفية الخاصة بكل معاملة. قم بإصابة الآبار بإضافة 50 ميكرولتر/بئر من الفيروس المخفف في وسط العدوى. يُحدد هذا الوقت على أنه الساعة 0 بعد العدوى (0 hpi). حضّن لمدة 6-24 ساعة في حاضنة عند 37 درجة مئوية + 5% ثاني أكسيد الكربون (CO2). 3. تثبيت الخلايا ثبّت الخلايا بإضافة 100 ميكرولتر من البارافورمالدهيد بتركيز 8% إلى وسط العدوى الموجود مسبقاً في كل بئر. حضّن في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة مع الحماية من الضوء. ملاحظة: يوصى بإضافة البارافورمالدهيد بتركيز 2x (8%) مباشرة إلى وسط العدوى لمنع تحول فيروس الجدري اللقاحي المعدي إلى رذاذ، وهو ما قد يحدث إذا تم قلب الأطباق التي تحتوي على وسط ذي عيار مرتفع مباشرة في وعاء النفايات قبل التثبيت. أزل المادة المثبتة عن طريق قلب الطبق في وعاء النفايات. أضف 100 ميكرولتر من محلول ملحي منظم بالفوسفات في درجة حرارة الغرفة. أغلق الطبق بغشاء لاصق شفاف بصرياً. ملاحظة: يمكن تخزين الأطباق عند 4 درجة مئوية إذا لم يتم قراءتها على الفور. تأكد من إعادة الأطباق المختومة إلى درجة حرارة الغرفة قبل القراءة لمنع التكثف من تشويه قياسات المطياف الضوئي. روزيل، د. ك.، وآخرون. فيروسات Vaccinia المراسلة لقياس الوظيفة الفيروسية في جميع مراحل التعبير الجيني. مجلة التجارب المرئية (J. Vis. Exp.) (2014)

يوضح هذا الفيديو طريقة لمراقبة تضاعف فيروس الفاكسينيا باستخدام مراسلين فلوريين يتم تنظيمهما بواسطة محفزات خاصة بمراحل معينة. يحدد التعبير المتسلسل للبروتينات الفلورية الخضراء والحمراء والزرقاء المراحل المبكرة والمتوسطة والمتأخرة من العدوى، مما يسمح بإجراء تحليل عالي الإنتاجية للتعبير الجيني الفيروسي الخاص بكل مرحلة.

البروتوكول

1. زراعة الخلايا

1. قم بفصل خلايا HeLa من الطبق وتخفيفها في وسط نمو (Dulbecco's Modified Eagle Medium [DMEM]، و2 mM L-glut، و10% fetal bovine serum [FBS]) لتصل إلى حوالي 2.0 x 10⁵ cells/ml. وزع 100 μl/well في طبق 96-well ذو جدران سوداء وقاع مسطح شفاف (20,000 cells/well).
2. حضن الخلايا لمدة 24 hr حتى تصبح متلاحمة (confluent) في حاضنة عند 37 °C + 5% CO₂.

2. إصابة الخلايا

1. تخفيف الفيروسات وإصابة الخلايا.
   1. إذابة الفيروسات الفلورية TrpV (الفيروس الثلاثي؛ Venus مبكر، mCherry متوسط، TagBFP متأخر) وPLV (Venus بدون محفز) وتفكيك التجمعات باستخدام الموجات فوق الصوتية لمدة 5 دقائق. بدلاً من ذلك، يمكن خلط مخزونات الفيروس الخام بنسبة 1:1 مع 0.25 mg/ml من التريبسين في وسط الإصابة وتحضينها عند 37 °C لمدة 30 دقيقة.
   2. تخفيف مخزونات الفيروس الخام في وسط إصابة بدرجة حرارة 37 °C (DMEM، و2 mM L-glut، و2% FBS). بالنسبة للإصابات ذات تعددية العدوى (MOI) العالية (10 PFU/cell)، يتم تخفيف مخزون الفيروس إلى 1.0 x 10⁷ PFU/ml بافتراض وجود 5 x 10⁴ خلايا/بئر وحجم لقاح يبلغ 50 μl. يجب التخطيط لإصابة 3 آبار مكررة لكل معاملة باستخدام TrpV و3 آبار مكررة أخرى لنفس المعاملة باستخدام PLV لحساب الفلورة الخلفية الخاصة بكل معاملة.
   3. إصابة الآبار عن طريق إضافة 50 μl/بئر من الفيروس المخفف في وسط الإصابة. يتم تحديد هذه اللحظة بأنها الزمن = 0 ساعة بعد الإصابة (0 hpi).
2. التحضين لمدة 6-24 ساعة في حاضنة عند 37 °C + 5% CO₂.

3. تثبيت الخلايا

1. قم بتثبيت الخلايا عن طريق إضافة 100 μl من البارافورمالدهيد بتركيز 8% إلى وسط العدوى الموجود بالفعل في كل بئر. تُحضن الخلايا في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 min مع حمايتها من الضوء.
   ملاحظة: يوصى بإضافة البارافورمالدهيد بتركيز مضاعف 2x (8%) مباشرة إلى وسط العدوى لمنع تحول فيروس الفاكسينيا المعدي إلى رذاذ جوي، وهو ما قد يحدث إذا تم تفريغ وسط العدوى عالي العيار مباشرة في وعاء النفايات قبل عملية التثبيت.
2. تخلص من المادة المثبتة عن طريق قلب اللوحة في وعاء النفايات.
3. أضف 100 μl من المحلول الملحي الملحق بالفوسفات (phosphate-buffered saline) في درجة حرارة الغرفة.
4. أغلق اللوحة بغشاء لاصق شفاف بصرياً.
   ملاحظة: يمكن تخزين اللوحات عند 4 °C إذا لم يتم قياسها على الفور. تأكد من إعادة اللوحات المختومة إلى درجة حرارة الغرفة قبل القياس لمنع التكثف من تشويه قياسات جهاز spectrophotometer.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
وسط دولبيكو المعدل إيغل (DMEM)	Gibco	11995-065
مصل جنين البقر - Optima، مثبط حرارياً (FBS)	Atlanta Biologicals	S12450H
إل-جلوتامين 200 mM، (L-glut)	Gibco	25030-081
أطباق ميكروية بـ 96 بئراً، ذات قاع شفاف مسطح وجدران سوداء من البوليسترين المعالج للزراعة النسيجية	Corning	3603
محلول ملحي منظم بالفوسفات (PBS)	Gibco	10010-023
فيلم TempPlate RT شفاف بصرياً	USA Scientific	2978-2700
وسط Opti-MEM منخفض المصل	Gibco	31985-070