عزل وتنقية الفيروسات من أجسام الحشرات المصابة

الملخص

استخلاص الفيروس الكامل قم بتجانس الأجسام الكاملة لحشرة *H. vitripennis* الموجبة للفيروس في محلول منظم من الفوسفات، بأس هيدروجيني (pH) يبلغ ~7.2، مع 0.02% من ثلاثي هيدرات ثنائي إيثيل ثنائي ثيوكربامات الصوديوم (DETCA)، وذلك عن طريق المزج الدوامي (vortexing) لفترات زمنية مدتها ~10 ثوانٍ حتى تختفي الكتل النسيجية الكبيرة. استخلص الفيروس عبر الطرد المركزي فائق السرعة عند 124,500 x g لمدة 4 ساعات في درجة حرارة 4 مئوية، أو عند 22,000 x g لمدة 16 ساعة في درجة حرارة 4 مئوية. في حالة تكون راسب في الأعلى، قم بإزالته باستخدام مسحة قطنية معقمة. تخلص من السائل الطافي. اجمع الراسب وأذِبْه في 5 مل من محلول منظم من الفوسفات بتركيز 10 ملي مولار (بدون DETCA)، بأس هيدروجيني يبلغ ~7.2، ويحتوي على 0.4% من حمض Na-deoxycholic و4% من بولي إيثيلين جليكول هيكساديسيل إيثر (Brij 52). لخلط الراسب جيداً، قم بإزالته من جدار الأنبوب وسحقه حتى يذوب في المحلول إذا لزم الأمر. أضف محلول منظم من الفوسفات بتركيز 10 ملي مولار بزيادات قدرها ~5 مل للمساعدة في إذابة الراسب عند الحاجة، ووزع المزيج على أنبوبين. قم بطرد المحلول مركزياً عند 300 x g لمدة 15 دقيقة. أزل السائل الطافي ومرر المحلول عبر مرشح بمسامية 0.45 ميكرومتر، واجمع الرشيح في أنبوب تجميع كبير. انقل الرشيح إلى غشاء دياليز (غشاء دياليزي) بحد قطع للوزن الجزيئي (MWCO) يبلغ 3.5 كيلو دالتون، باستخدام كميات صغيرة من محلول منظم من الفوسفات بتركيز 10 ملي مولار (pH 7) لا يحتوي على DETCA عند الحاجة. ضع غشاء الدياليز في دورق كبير مملوء بماء مقطر مزدوج (ddH2O) في درجة حرارة 4 مئوية. استبدل الماء المقطر المزدوج كل ساعة لمدة 5-6 ساعات، حتى يتكون راسب أبيض داخل الغشاء. اجمع الفيروس المُنقى من داخل الغشاء، وأخضع محلول الفيروس بتركيز 100% لسلسلة تخفيف بمقدار 10 أضعاف عن طريق إضافة 10 ميكرولتر من المحلول إلى 90 ميكرولتر من الماء المقطر المزدوج. بعد ذلك، أضف 10 ميكرولتر من التخفيف إلى 90 ميكرولتر أخرى من الماء المقطر المزدوج حتى يصل التخفيف إلى 1:100,000. احفظ محلول الفيروس في درجة حرارة -80 مئوية. بيسبروك، أ. م. وآخرون. إكثار فيروس Homalodisca coagulata-01 عن طريق Homalodisca vitripennis زراعة الخلايا. مجلة جوف (J. Vis. Exp.) (2014)

يوضح هذا الفيديو كيفية تكاثر فيروس Homalodisca coagulata Virus-01 في المختبر باستخدام خلايا مضيفة مشتقة من الحشرات. كما يستعرض خطوات تنقية الفيروس، والتلقيح، والتضاعف داخل الخلايا الحشرية المستنبتة.

البروتوكول

1. استخلاص الفيروس الكامل

1. قم بتجنيس الأجسام الكاملة لحشرات H. vitripennis الموجبة للفيروس في محلول فوسفات منظم، pH ~7.2، يحتوي على 0.02% من ثلاثي هيدرات ثنائي إيثيل ثنائي ثيوكربامات الصوديوم (DETCA) عن طريق الرج الدوامي (vortexing) لفترات زمنية تبلغ ~10 ثوانٍ حتى تختفي جميع التكتلات النسيجية الكبيرة. استخلص الفيروس عبر الطرد المركزي فائق السرعة عند 124,500 x g لمدة 4 hr عند 4 °C أو عند 22,000 x g لمدة 16 hr عند 4 °C. في حال تكون راسب في الأعلى، قم بإزالته باستخدام مسحة قطنية معقمة.
2. تخلص من السائل الطافي.
3. اجمع الراسب وأذِبه في 5 ml من محلول فوسفات منظم بتركيز 10 mM (بدون DETCA)، pH ~7.2، يحتوي على 0.4% من حمض Na-deoxycholic و 4% من بولي إيثيلين جليكول هيكساديسيل إيثر (Brij 52).
   1. لخلط الراسب جيداً، افصله عن جانب الأنبوب وقم بسحقه حتى يذوب تماماً في المحلول، إذا لزم الأمر.
   2. أضف كميات إضافية من محلول الفوسفات المنظم بتركيز 10 mM بزيادات قدرها ~5 ml للمساعدة في إذابة الراسب عند الحاجة، ثم وزع المحلول على أنبوبين.
4. قم بطرد المحلول مركزياً عند 300 x g لمدة 15 min.
5. أزل السائل الطافي ومرر المحلول عبر مرشح بمسامية 0.45 μm، واجمع الرشاحة في أنبوب تجميع كبير.
6. انقل الرشاحة إلى غشاء دياليز (غشاء ديالزة) بحد قطع للوزن الجزيئي (MWCO) يبلغ 3.5 kD، مع استخدام كميات صغيرة من محلول الفوسفات المنظم بتركيز 10 mM (pH 7) الخالي من DETCA عند الحاجة.
7. ضع غشاء الدياليز في بيكر كبير مملوء بـ ddH₂O عند 4 °C. استبدل ddH₂O كل ساعة لمدة 5 - 6 hr، حتى يتكون راسب أبيض داخل الغشاء.
8. اجمع الفيروس المنقى من داخل الغشاء، وأخضع محلول الفيروس بتركيز 100% لسلسلة تخفيفات بمقدار 10 أضعاف عن طريق إضافة 10 μl من المحلول إلى 90 μl من ddH₂O. بعد ذلك، أضف 10 μl من التخفيف إلى 90 μl أخرى من ddH₂O حتى تصل إلى تخفيف بنسبة 1:100,000.
9. خزّن محلول الفيروس عند -80 °C.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
Corning cell culture flasks	Sigma Aldrich	CLS430168	مساحة السطح 25 cm²، عنق مائل، غطاء (سدادة محكمة)
Olympus DP30BW, IX2-SP, IX71	Olympus		مجهر مقلوب وكاميرا
Greiner CELLSTAR multiwell culture plates	Sigma Aldrich	M8937	48 بئراً (معالجة بالـ TC مع غطاء)
DETCA	Sigma Aldrich	228680	Sodium diethyldithiocarbamate trihydrate
Corning bottle-top vacuum filter system	Sigma Aldrich	CLS431206	غشاء من أسيتات السليلوز، حجم المسام 0.45 μm، مساحة الغشاء 54.5 cm²، سعة الترشيح 500 ml
Brij 52	Sigma Aldrich	388831	Polyethylene glycol hexadecyl ether
Phosphate buffer solution	Sigma Aldrich	P5244	استُلِم بتركيز 100 mM وخُفف إلى 10 mM باستخدام ماء معقم
PBS	Sigma Aldrich	P5368	Phosphate buffered saline
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma Aldrich	A2153
Grace’s Insect medium (supplemented, 1x)	Sigma Aldrich	G8142	مكون وسط H2G+ ليرقات نطاطات الأوراق
L-histidine monohydrate	Sigma Aldrich	H8125	مكون وسط H2G+ ليرقات نطاطات الأوراق
Medium 199 (10x)	Sigma Aldrich	M4530	مكون وسط H2G+ ليرقات نطاطات الأوراق
Medium 1066 (1x)	Sigma Aldrich	C0422	مكون وسط H2G+ ليرقات نطاطات الأوراق
Hank’s Balanced Salts (1x)	Sigma Aldrich	51322C	مكون وسط H2G+ ليرقات نطاطات الأوراق
L-Glutamine (100x)	Sigma Aldrich	G3126	مكون وسط H2G+ ليرقات نطاطات الأوراق
MEM, amino acid mix (50x)	Sigma Aldrich	56419C	مكون وسط H2G+ ليرقات نطاطات الأوراق
1 M MgCl solution	Sigma Aldrich	M8266	مكون وسط H2G+ ليرقات نطاطات الأوراق
Pen-Strep	Sigma Aldrich	G6784	مكون وسط H2G+ ليرقات نطاطات الأوراق
Nystatin	Sigma Aldrich	N6261	مكون وسط H2G+ ليرقات نطاطات الأوراق
Gentamycin	Sigma Aldrich	46305	مكون وسط H2G+ ليرقات نطاطات الأوراق
Dextrose	Sigma Aldrich	D9434	مكون وسط H2G+ ليرقات نطاطات الأوراق
Fetal Bovine Serum	Sigma Aldrich	F2442	مكون وسط H2G+ ليرقات نطاطات الأوراق