توليد الفيروسات lentivirus المؤشبة في الخلايا الثديية

الملخص

1. إنشاء نظام تعبئة فيروسي بطيء مركز لعوامل النسخ إنتاج الفيروس المركز (الشكل 1 أ، ب) 1.1.1 استزراع 1.5 × 10^6 من خلايا HEK-293T (خلايا الكلية الجنينية البشرية) في طبق قطر 60 ملم، وتنمية هذه الخلايا في وسط عادي (انظر الجدول 1) عند درجة حرارة 37 مئوية في حاضنة رطبة بنسبة 5% من ثاني أكسيد الكربون (CO2). ملاحظة: إذا كانت هناك حاجة لتعبئة الفيروس في دفعات، يمكن استخدام طبق استزراع خلايا قطر 100 ملم (للتفاصيل، انظر الجدول 2). 1.1.2 بعد مرور 24 ساعة، تأكد من وصول خلايا HEK-293T إلى درجة تلاقي تتراوح بين 80-90% في يوم نقل الجينات، واستبدل الوسط بـ 3.5 مل من DMEM (وسط دولبيكو المعدل) (بمعدل 150 ميكرولتر من DMEM لكل 1 سم مربع). اترك الخلايا عند درجة حرارة 37 مئوية في حاضنة رطبة بنسبة 5% من ثاني أكسيد الكربون (CO2) لمدة ساعتين. ملاحظة: يجب أن يكون الوسط المستبدل خالياً من المصل، وذلك لتمكين "تجويع" الخلايا من أجل تحسين عملية ترنسفكشن البلازميد. 1.1.3 تحضير خليط البلازميدات (الخليط أ) الذي يحتوي على 3 ميكروغرام من البلازميدات المستهدفة لـ Mitf أو Sox10 أو Pax3 أو Sox2 أو Sox9 أو Snai2؛ و1 ميكروغرام من بلازميد التعبئة PMD2.G، و2 ميكروغرام من بلازميد التعبئة PSPAX2. أكمل حجم الخليط أ إلى 150 ميكرولتر باستخدام DMEM خالٍ من المصل. تحضير خليط كاشف الترنسفكشن (الخليط ب) بإضافة 12 ميكرولتر من كاشف الترنسفكشن (يكون الحجم ضعف الكتلة الكلية لجميع البلازميدات)، وأكمل حجم الخليط ب إلى 150 ميكرولتر باستخدام DMEM خالٍ من المصل. ملاحظة: عند تحضير الخلائط، من المهم إضافة السائل ببطء لتجنب تكون فقاعات الهواء. 1.1.4 ادمج الخليط أ والخليط ب بعد تركهما لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. قم بحضن الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 20-30 دقيقة لتكوين معقد الترنسفكشن. 1.1.5 أخرج خلايا HEK-293T من الحاضنة، واستبدل الوسط بـ DMEM + 2% FBS (مصل جنين البقر)، وأضف الخليط من الخطوة 1.1.4 قطرة بقطرة، وامزج السائل بلطف. 1.1.6 بعد مرور 8 ساعات، استبدل الوسط بـ 3.5 مل من الوسط العادي. بعد تغيير الوسط، اجمع المادة الطافية الفيروسية كل 24 ساعة و48 ساعة. 1.1.7 امزج المواد الطافية الفيروسية التي جُمعت في نقطتين زمنيتين مختلفتين. قم بالطرد المركزي عند 200 × g لمدة 5 دقائق عند درجة حرارة 4 مئوية. مرر المادة الطافية عبر مرشحات 0.45 ميكرومتر واجمعها في أنبوب مخروطي معقم سعة 50 مل. ملاحظة: يمكن تخزين الفيروس الذي جُمع عند 24 ساعة في درجة حرارة 4 مئوية ومزجه مع الفيروس الذي جُمع عند 48 ساعة. 1.1.8 ركز المادة الطافية الفيروسية عن طريق الطرد المركزي عند 6000 × g عند درجة حرارة 4 مئوية طوال الليل (حوالي 16 ساعة). تأكد من ظهور كريّة الفيروس في قاع الأنبوب المخروطي بعد الطرد المركزي. 1.1.9 اسكب المادة الطافية ببطء. أذب كريّة الفيروس في حجم من الوسط العادي يعادل 1/100 من حجم المادة الطافية الفيروسية. باستخدام ماصة ميكرومترية P1000، قم بالسحب والدفع بلطف حتى يتم الحصول على خليط متجانس. قسم الفيروس المركز في أنابيب طرد مركزي دقيقة حسب الحاجة. يُخزن عند -80 درجة مئوية. ملاحظة: يتم تركيز الفيروس بمقدار 100 ضعف بهذه الطريقة. يمكن تخزين الفيروس المركز (100 ضعف) لأكثر من سنة عند -80 درجة مئوية. تجنب تكرار تجميد وإذابة الفيروس. الجدول 1: مكونات الأوساط العادية وأوساط إعادة البرمجة. المكونات | الجرعة (التركيز، الحجم) | التركيز النهائي --- | --- | --- الوسط العادي (100 مل) | | DMEM/ جلوكوز عالٍ | 89 مل | FBS مثبط حرارياً | 10 مل | المضادات الحيوية (بن/سترب) | 10000 وحدة/مل، 1 مل | 100 وحدة/مل وسط إعادة البرمجة (100 مل) | | RPMI-1640 | 88 مل | FBS مثبط حرارياً | 10 مل | SCF بشري مأشوب | 200 ميكروغرام/مل، 50 ميكرولتر | 100 نانوغرام/مل bFGF بشري مأشوب | 4 ميكروغرام/مل، 250 ميكرولتر | 10 نانوغرام/مل إنسولين بشري مأشوب | 10 ملغم/مل، 50 ميكرولتر | 5 ميكروغرام/مل EDN3 بشري | 100 ميكرومولار، 100 ميكرولتر | 0.1 ميكرومولار ذيفان الكوليرا | 0.3 ملغم/مل، 0.56 ميكرولتر | 20 ميلي مولار فوربول 12-ميريستات 13-أسيتات (TPA) | 1 ميلي مولار، 20 ميكرولتر | 200 نانو مولار هيدروكورتيزون | 100 ميكروغرام/مل، 500 ميكرولتر | 0.5 ميكروغرام/مل أدينين | 40 ملغم/مل، 60 ميكرولتر | 24 ميكروغرام/مل الجدول 2: تفاصيل نظام تعبئة الفيروس البطئ. طبق الاستزراع | كثافة الاستزراع (خلية/طبق) | الوسط (مل) | نظام البلازميد | كاشف الترنسفكشن (ميكرولتر) | البلازميد المستهدف (ميكروغرام) | PMD2.G (ميكروغرام) | PSPAX2 (ميكروغرام) --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- 35 ملم | 6 × 10^5 | 1.5 | 1.5 | 0.5 | 1 | 1 | 1 60 ملم | 1.5 × 10^6 | 3.5 | 3 | 1 | 2 | 2 | 2 100 ملم | 4 × 10^6 | 8 | 8 | 3 | 6 | 3 | 4 تشانغ، واي.، وآخرونإعادة البرمجة المباشرة للخلايا الليفية الفأرية إلى خلايا ميلانينية. مجلة التجارب المرئية (J. Vis. Exp.) (2021)

يوضح هذا الفيديو كيفية إنتاج وتركيز الفيروسات البطيئة المؤتلفة في الخلايا الثديية، مما يتيح توصيلاً فعالاً للجينات الخاصة بعوامل النسخ أو العناصر الجينية الأخرى لتطبيقات مثل إعادة برمجة الخلايا، والدراسات الوظيفية، والأبحاث العلاجية المحتملة.

البروتوكول

1. إنشاء نظام تعبئة فيروسي بطيء مركز لعوامل النسخ

1. إنتاج الفيروس المركز (الشكل 1أ، ب)
   1. ازرع 1.5 × 10⁶ خلايا HEK (كلية جنينية بشرية)-293T في طبق بقطر 60 مم، وتُزرع هذه الخلايا باستخدام الوسط العادي (انظر جدول 1) في 37 °C في حاضنة رطبة تحتوي على 5% من ثاني أكسيد الكربون (CO2)₂.
      ملاحظة: إذا كانت هناك حاجة لتعبئة الفيروس في دفعات، يمكن استخدام طبق زراعة خلايا بقطر 100 مم (للتفاصيل، انظر جدول 2).
   2. بعد مرور 24 ساعة، تأكد من وصول خلايا HEK-293T إلى درجة تلاقي تتراوح بين 80-90% في يوم التنقل الجيني، واستبدل الوسط بـ 3.5 مل من وسط DMEM (وسط إيجل المعدل من قبل دولبكو) (150 µL من DMEM لكل 1 سم2²). اترك الخلايا عند 37 °C في حاضنة رطبة تحتوي على 5% من ثاني أكسيد الكربون (CO2)₂ لمدة ساعتين.
      ملاحظة: يجب أن يكون الوسط المستبدل خالياً من المصل، حتى يتسنى للخلايا أن تكون "مُجوعة (في حالة تجويع خلوي)" لتحسين عملية ترنسفكشن البلازميد.
   3. قم بتحضير خليط البلازميدات (الخليط أ) الذي يحتوي على 3 µg من البلازميدات المستهدفة لكل من Mitf أو Sox10 أو Pax3 أو Sox2 أو Sox9 أو Snai2؛ 1 µg من بلازميد التعبئة PMD2.G، و 2 µg من البلازميد التغليفي PSPAX2. أكمل حجم المزيج A إلى 150 µL بمستنبت DMEM الخالي من المصل. قم بتحضير خليط كاشف عفن ترانسفكشن (الخليط ب) عن طريق إضافة 12 µL من كاشف عفن الخلية (بحيث يكون الحجم ضعف الكتلة الكلية لجميع البلازميدات)، وأكمل حجم الخليط ب إلى 150 µL بواسطة وسط DMEM الخالي من المصل.
      ملاحظة: عند تحضير الخلائط، من المهم إضافة السائل ببطء لتجنب تكون فقاعات هوائية.
   4. اجمع المزيج (أ) والمزيج (ب) بعد تركهما لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. ثم حضّن الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة تتراوح بين 20 و30 دقيقة لتكوين مُعقّد ترانسفكشن (transfection complex).
   5. أخرج خلايا HEK-293T من الحاضنة، واستبدل الوسط بوسط DMEM + 2% FBS (مصل جنين البقر)، ثم أضف المزيج الناتج من الخطوة 1.1.4 قطرة تلو الأخرى، واخلط السائل برفق.
   6. بعد مرور 8 ساعات، يتم تغيير الوسط بـ 3.5 مل من الوسط العادي. وبعد تغيير الوسط، يتم جمع المادة الطافية للفيروس عند كل من 24 و48 ساعة.
   7. امزج السوائل الطافية للفيروس التي تم جمعها في نقطتين زمنيتين مختلفتين. ثم قم بالطرد المركزي عند 200 × جت لمدة 5 دقائق عند 4 °Cمرّر السائل الطافي عبر 0.45 µm المرشحات وجمع السائل في أنبوب مخروطي معقم سعة 50 مل.
      ملاحظة: يمكن تخزين الفيروس الذي تم جمعه عند 24 ساعة في درجة حرارة 4 °C وخلطه مع الفيروس الذي تم جمعه عند 48 ساعة.
   8. ركّز الطافي الفيروسي عن طريق الطرد المركزي بسرعة 6000 × ج عند 4 °C طوال الليل (حوالي 16 ساعة). وتأكد من ظهور كتلة الفيروس (virus pellet) في قاع الأنبوب المخروطي بعد عملية الطرد المركزي.
   9. اسكب الطافي ببطء. أذِب كريّة الفيروس في حجم من الوسط العادي يعادل 1/100^th من حجم السائل الطافي للفيروس. وباستخدام ماصة دقيقة P1000، يتم السحب والدفع بلطف حتى يتم الحصول على مزيج متجانس. ثم يُقسم الفيروس المُركَّز في أنابيب طرد مركزي دقيقة حسب الحاجة، ويُحفظ عند درجة حرارة −80 °C.
      ملاحظة: يتم تركيز الفيروس بمقدار 100 ضعف باستخدام هذه الطريقة. ويمكن تخزين الفيروس المركز (100 ضعف) لمدة >سنة واحدة عند درجة حرارة −80 °Cتجنب تكرار تجميد الفيروس وإذابته.

الجدول 1: مكونات أوساط الزرع العادية وأوساط إعادة البرمجة.

	المكونات	الجرعة (التركيز، الحجم)	التركيز النهائي
الوسط العادي (100 mL)	DMEM/HIGH GLUCOSE	89 mL
	FBS مثبط حرارياً	10 mL
	مضادات حيوية (Pen/Strep)	10000 U/mL, 1 mL	100 U/mL
وسط إعادة البرمجة (100 mL)	RPMI-1640	88 mL
	FBS مثبط حرارياً	10 mL
	SCF بشري مؤتلف	200 μg/mL, 50 μL	100 ng/mL
	bFGF بشري مؤتلف	4 μg/mL, 250 μL	10 ng/mL
	إنسولين بشري مؤتلف	10 mg/mL, 50 μL	5 μg/mL
	EDN3 بشري	100 μM, 100 μL	0.1 μM
	ذيفان الكوليرا	0.3 mg/mL, 0.56 μL	20 pM
	Phorbol 12-myristate 13-acetate (TPA)	1 mM, 20 μL	200 nM
	هيدروكورتيزون	100 μg/mL, 500 μL	0.5 μg/mL
	أدينين	40 mg/mL, 60 μL	24 μg/mL

الجدول 2: تفاصيل نظام تعبئة الفيروسات البطيئة.

طبق الزرع	كثافة الاستزراع (خلية/طبق)	الوسط (mL)	نظام البلازميد			كاشف عفن الخلية (µL)
			البلازميد المستهدف (μg)	PMD2.G (μg)	PSPAX2 (μg)
35 mm	6 ×105	1.5	1.5	0.5	1	6
60 mm	1.5 × 106	3.5	3	1	2	12
100 mm	4 × 106	8	8	3	6	34

النتائج

الشكل 1: إنتاج الفيروس المركز وتقدير العيار. (A) كثافة تألق GFP (البروتين الفلوري الأخضر) بعد إصابة خلايا HEK-293T بفيروس لينتي غير مركز (1x) وفيروس لينتي مركز (100x) (B) مقارنة بمعدلات الإصابة للفيروس اللينتي غير المركز (1x) والفيروس اللينتي المركز (100x) كما تم الكشف عنها بواسطة قياس التدفق الخلوي. (C) تقدير عيار الفيروس اللينتي المركز. أشرطة المقياس = 250 µm. الاختصارات: GFP = البروتين الفلوري الأخضر؛ TU = وحدات نقل الجينات.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
مرشح 0.45 μM	Millipore	SLHVR33RB
إيثانول 95%/100%	LANBAO	210106	يُحفظ في درجة حرارة الغرفة
مضادات حيوية (Pen/Strep)	Gibco	15140-122	يُحفظ في درجة حرارة -20 °C
جسم مضاد Anti-TRP2/DCT	Abcam	ab74073	المضيف/النمط: Rabbit IgG، التفاعل النوعي: الفأر/الإنسان، التخفيف المستخدم 1:200
وسط DMEM (جلوكوز مرتفع)	HyClone	SH30243.01	يُحفظ في درجة حرارة 4 °C
DMSO	Sigma	D2650	يُحفظ في درجة حرارة الغرفة
FBS	Gibco	10270-106	يُحفظ في درجة حرارة -20 °C، ويُثبط حرارياً قبل الاستخدام
جيلاتين	Sigma	G9391	يُحفظ في درجة حرارة الغرفة
بلازميدات GFP-PURO (Mitf وSox10 وPax3 وSox2 وSox9 وSnai2)	Hanheng Biological Technology Co., Ltd.	pHBLPm003198 pHBLPm001143 pHBLPm002968 pHBLPm002981 pHBLPm004348 pHBLPm000325	تُحفظ في درجة حرارة -20 °C
هيماتوكسيلين	Abcam	ab220365	يُحفظ في درجة حرارة الغرفة
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668-019	كاشف عفن، يُحفظ في درجة حرارة 4 °C
PBS (-)	Gibco	C10010500BT	يُحفظ في درجة حرارة الغرفة
فوربول 12-ميريستات 13-أسيتات (TPA)	Sigma	P8139	تركيز المخزون 1 mM، التركيز النهائي 200 nM
بوليبرين	Sigma	H9268	كاشف عفن بوليمري كاتيوني؛ تركيز المخزون 8 μg/µL، التركيز النهائي 4 ng/µL
بورومايسين	Gibco	A11138-03	يُحفظ في درجة حرارة -20 °C
عامل نمو bFGF بشري مأشوب	Invitrogen	13256-029	تركيز المخزون 4 μg/mL، التركيز النهائي 10 ng/mL
إنسولين بشري مأشوب	Sigma	I3536	تركيز المخزون 10 mg/mL، التركيز النهائي 5 µg/mL