إنتاج جسيمات شبيهة بالفيروس قادرة على النسخ والتضاعف من فيروس إيبولا تحتوي على بروتين تقريري

الملخص

المصدر: Hoenen, T., et al. نمذجة دورة حياة فيروس إيبولا تحت ظروف المستوى الثاني من السلامة البيولوجية باستخدام جسيمات شبيهة بالفيروسات تحتوي على مين جينومات رباعية السيسترون. J. Vis. Exp. (2014)

يوضح هذا الفيديو كيفية ترانسفكشن بلازميد ميني جينوم رباعي السيسترون (tetracistronic minigenome plasmid) يحاكي جينوم فيروس إيبولا في خلايا بشرية جنباً إلى جنب مع بلازميدات مساعدة. داخل الخلايا، يتم التعبير عن البروتينات الفيروسية واللوسيفيريز، مما يؤدي إلى تجميع وتبرعم جسيمات شبيهة بالفيروسات غير ممرضة وقادرة على التضاعف.

البروتوكول

1. ترنسفكشن الخلايا المنتجة للإنتاج الأولي للجسيمات الشبيهة بالفيروسات القادرة على النسخ والتضاعف أو trVLPs

1. بعد مرور 24 ساعة على تقسيم الخلايا (انظر الشكل 1 للحصول على نظرة عامة على التوقيت الزمني للتجربة)، انقُل الحمض النووي البلازميدي باستخدام الماصة (للمعرفة بالكميات، انظر جدول 1) في أنبوب حفظ تجميد (cryovial) معقم سعة 2 مل باستخدام رؤوس ماصات مزودة بمرشحات. أضف 100 µL من OptiMEM لكل بئر إلى الحمض النووي DNA. يتم رج المزيج بجهاز Vortex لفترة وجيزة، ثم تدوير الأنابيب بلطف باستخدام جهاز طرد مركزي صغير (microfuge). وفي حال كان من المقرر إجراء عملية عفن (transfection) لعدة آبار باستخدام بلازميدات متطابقة، يمكن تحضير مزيج رئيسي (master mix) يكفي لعدة آبار.
2. قم برج القارورة التي تحتوي على Transit LT1 لفترة وجيزة باستخدام جهاز الرج (vortex) قبل الاستخدام. أضف 7.5 µL من Transit LT1 لكل بئر إلى الحمض النووي (DNA) المُخفف. رُجّ المزيج بلطف باستخدام جهاز الرج (vortex)، مع الحرص على عدم تجمع السائل في غطاء أنبوب الحفظ المبرد (cryovial)، ثم اتركه للتحضين لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
3. امزج معقد عفن الخلية (transfection complex) برفق عن طريق السحب والدفع بالماصة. أضف 100 µL من معقدات transfection قطرة تلو الأخرى في كل بئر. قم بهز الطبق للأمام والخلف ومن جانب إلى آخر لتوزيع معقدات transfection. لا تقم بتدوير الطبق بشكل دائري لأن ذلك سيؤدي إلى توزيع غير متساوٍ لمعقدات transfection.
4. أعد الخلايا إلى الحاضنة.
5. بعد مرور 24 ساعة، قم بإزالة الطافي من الخلايا. أضف 4 مل من وسط DMEM (وسط ديولبيكو المعدل إيغل) مع 5% من FBS (مصل بقري جنيني)، و2 ملي مولار من L-glutamine، و1x من pen/strep (بنسلين/ستربتوميسين) (DMEM5) إلى الخلايا. يمكن تنفيذ هذه الخطوة لما يصل إلى 3 آبار في وقت واحد دون أن تجف الآبار، بشرط أن تحتوي الآبار على عينات متطابقة (وإلا، وبسبب الطبيعة ذاتية التضخيم لـ trVLPs (الجسيمات الشبيهة بالفيروسات القادرة على النسخ والتضاعف) في هذا النظام، قد تصبح التلوث الخلطي مشكلة، وفي هذه الحالة يجب تنفيذ هذه الخطوة لكل بئر على حدة).
6. أعد الخلايا إلى الحاضنة.

الجدول 1. كميات DNA لعملية transfection. تظهر كمية كل بلازميد مطلوبة لعملية transfection للخلايا المنتجة والخلايا المستهدفة بوحدة ng لكل بئر في طبق مكون من 6 آبار.

	الخلايا المنتِجة (p0)	الخلايا المستهدفة (p1 وما فوق)
pCAGGS-NP	125	125
pCAGGS-VP35	125	125
pCAGGS-VP30	75	75
pCAGGS-L	1,000	1,000
p4cis-vRNA-RLuc	250	-
pCAGGS-T7	250	-
pCAGGS-Tim1	-	250

النتائج

الشكل 1. التوقيت الزمني لمقايسة trVLP رباعية السيسترون لـ 3 ممرات متتالية. تم تحديد الأيام المخصصة لاستزراع الخلايا (s)، وتعداء الخلايا (t)، وإصابة الخلايا (i)، وتغيير الوسط (c)، وحصاد الخلايا وtrVLPs (h) لثلاث ممرات متتالية (مشار إليها بالأسهم).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
دورق زراعة خلايا 75 cm²	Corning	430641
DMEM	Sigma	D6546	يُسخن مسبقاً إلى 37°C قبل الاستخدام
FBS	Life technologies	26140-079	تعطيل حراري لمدة 30 min عند 56°C
L-Glutamine	Life Technologies	25030-081	100x
Pen/strep	Life Technologies	15070-063	100x
أطباق 6-well	Costar	3516
Opti-MEM I	Life Technologies	31985-070
Transit LT1	Mirus	MIR 2300