مقايسة قائمة على اللوسيفيريز لتقييم المركبات المضادة للفيروسات في خلايا الكلى الجنينية البشرية

الملخص

1. تحضير المزارع الخلوية المصابة بفيروس الحصبة (MV) الذي يعبر عن لوسيفيراز اليراعة (rMV2/Luc) قم بتنمية خلايا HEK-293T عند درجة حرارة 37 درجة مئوية و5% من ثاني أكسيد الكربون (CO2) في وسط ديلبيكو المعدل (DMEM) مع L-glutamine المستقر والمكمل بنسبة 10% من مصل العجل الجنيني (FCS)، وستريبتومايسين (100 ميكروغرام/مل)، وبنسلين (100 وحدة دولية/مل). يتم تمرير الخلايا عن طريق المعالجة بالتريبسين كل 4-5 أيام وتخفيفها بنسبة 1:10 في دورق جديد. يجب أن تكون الخلايا في طور النمو اللوغاريتمي عند إجراء التجارب. في يوم التجربة، استعد الخلايا عن طريق المعالجة بالتريبسين وقم بعدّ الخلايا. قم بترسيب الخلايا عن طريق الطرد المركزي، وأعد تعليقها بتركيز 3 × 10^5 خلية/مل في وسط الزرع. ضع في الاعتبار أن كل لوحة فحص تتطلب 12.5 مل من معلق الخلايا. مرة أخرى، أعد تعليق الخلايا بتركيز 3 × 10^5 خلية/مل في وسط الزرع. ضع في الاعتبار أن كل لوحة فحص تتطلب 12.5 مل من معلق الخلايا. اختياري: قم بتكملة وسط الزرع باليوريدين بتركيز 20 ميكروغرام/مل. ملاحظة: عند فحص المكتبات الكيميائية بحثاً عن مثبطات التضاعف الفيروسي، يبدو أن المركبات التي تستهدف الخطوات المبكرة من مسار الاصطناع الحيوي للبيريميدين تُعزل بشكل متكرر. تُستخدم إضافة اليوريدين إلى وسط الزرع لتصفية هذه الجزيئات المضادة للفيروسات؛ حيث يؤدي ذلك فعلياً إلى استعادة التضاعف الفيروسي عندما يتم حظر الإنزيمات الموجودة في بداية مسار الاصطناع الحيوي للبيريميدين. احفظ نسبة 1:10 من معلق الخلايا لاستخدامها في آبار التحكم التي تحتوي على خلايا غير مصابة، وباشر عملية الإصابة بالحجم المتبقي. قم بإذابة الحجم المناسب من المحلول المخزون لـ rMV2/Luc. عادةً ما تكون المحاليل المخزونة لفيروس MV بتركيز 10^6-10^8 جسيم معدٍ لكل مل. يجب إصابة المزرعة بـ 0.1 جسيم معدٍ من rMV2/Luc لكل خلية مستهدفة، وهو ما يعادل تعدد إصابة (MOI) قدره 0.1. ملاحظة: يُشتق rMV2/Luc من لقاح MV (سلالة Schwarz) ويتم التعامل معه في بيئة مستوى السلامة البيولوجية الثاني (BSL2). أضف الفيروس إلى معلق الخلايا وامزجه بلطف. انقل الخلايا المصابة إلى حوض، ووزع 100 ميكرولتر من معلق الخلايا المصابة في الأعمدة من 2 إلى 11 من لوحات D2 التي تحتوي على المركبات الكيميائية المضافة. يتم مزج معلق الخلايا داخل الحوض بلطف وبشكل منتظم. في العمودين 1 و12، وزع 100 ميكرولتر من الخلايا غير المصابة في كل بئر. يتم توزيع الخلايا المصابة في الآبار الأخرى. حضن الخلايا لمدة 24 ساعة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية و5% من ثاني أكسيد الكربون (CO2). 2. الفحص الثانوي للسمية والنشاط المضاد للفيروسات واسع الطيف قم بإجراء تخفيفات تسلسلية بنسبة 1:2 لكل مركب واعد في ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO)، بدءاً من 500 ميكرومولار إلى 4 ميكرومولار (8 تخفيفات). املأ لوحات زراعة الأنسجة البيضاء ذات الرموز الشريطية بـ 50 ميكرولتر من وسط الزرع. أضف 1 ميكرولتر من كل تخفيف للمركب في آبار الزرع. كرر العملية مرتين للحصول على 3 لوحات زرع تحتوي على تخفيفات تسلسلية مكررة لكل مركب واعد. حضّر 37.5 مل من معلق خلايا HEK-293T بتركيز 6 × 10^5 خلية/مل في وسط الزرع كما هو موضح أعلاه (في 1.1 و1.2). وزع مرتين 12.5 مل في أنابيب Falcon وأصب الخلايا إما بفيروس rMV2/Luc عند MOI = 0.1 أو بفيروس شيكونغونيا المؤتلف (CHIKV) الذي يعبر عن لوسيفيراز رينيلا (CHIKV/Ren) عند MOI = 0.2. امزج عن طريق القلب. ملاحظة: يُشتق CHIKV/Ren من سلالة برية من CHIKV، وبالتالي يجب التعامل معه في بيئة مستوى السلامة البيولوجية الثالث (BSL3). يمكن نقل اللوحات من BSL3 إلى BSL1 بمجرد إضافة ركيزة رينيلا إلى آبار الزرع (انظر أدناه). وزع 50 ميكرولتر من الخلايا غير المصابة، أو المصابة بـ rMV2/Luc، أو المصابة بـ CHIKV/Ren في لوحات الزرع التي تحتوي على التخفيفات التسلسلية للمركبات الواعدة. حضنها لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية. أضف 50 ميكرولتر من ركيزة لوسيفيراز اليراعة لتحديد نشاط لوسيفيراز اليراعة في الآبار المصابة بـ rMV2/Luc. أضف 50 ميكرولتر من ركيزة لوسيفيراز رينيلا لتحديد نشاط لوسيفيراز رينيلا في الآبار المصابة بـ CHIKV/Ren. أخيراً، أضف 50 ميكرولتر من كاشف مقايسة الحيوية القائم على اللوسيفيراز إلى الخلايا غير المصابة لتحديد الحيوية الخلوية. قم بتمثيل البيانات بيانياً (الشكل 1) وتحديد تركيزات المركبات الواعدة التي تثبط تضاعف MV وCHIKV بنسبة 50%. استبعد المركبات التي تظهر بعض السمية في هذه المقايسة. لوكاس-هوراني، م. وآخرون. الفحص عالي الإنتاجية للمثبطات الكيميائية واسعة الطيف للفيروسات ذات الحمض النووي الريبي (RNA). مجلة التجارب المرئية (J. Vis. Exp.) (2014)

يوضح هذا الفيديو مقايسة مضادة للفيروسات تعتمد على اللوسيفيراز في خلايا الكلية الجنينية البشرية المصابة بفيروس الحصبة المؤتلف. ويظهر أن المركبات المختبرة والمخففة تسلسلياً تثبط التكاثر الفيروسي، مما يؤدي إلى انخفاض التألق بأسلوب يعتمد على الجرعة مع الحفاظ على حيوية الخلية المضيفة.

البروتوكول

1. تحضير المزارع الخلوية المصابة بفيروس الحصبة (MV) الذي يعبر عن لوسيفيريز اليراعة (rMV2/Luc)

1. قم بتنمية خلايا HEK-293T عند 37 °C و5% CO₂ في وسط Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) مع L-glutamine مستقر، مضافاً إليه 10% مصل جنين العجل (FCS)، وstreptomycin بتركيز (100 μg/ml) وpenicillin بتركيز (100 IU/ml). يتم تمرير الخلايا عن طريق التريبسين (trypsinization) كل 4-5 أيام وتخفيفها بنسبة 1:10 في دورق جديد. يجب أن تكون الخلايا في مرحلة النمو اللوغاريتمي (log phase) عند إجراء التجارب.
2. في يوم التجربة، استعد الخلايا بواسطة التريبسين وأجرِ عملية عد الخلايا. قم بترسيب الخلايا عن طريق الطرد المركزي، ثم أعد تعليقها بتركيز 3 x 10⁵ خلية/مل في وسط الزرع. ضع في الاعتبار أن كل لوحة فحص تتطلب 12.5 ml من معلق الخلايا.
3. مرة أخرى، أعد تعليق الخلايا بتركيز 3 x 10⁵ خلية/مل في وسط الزرع. ضع في الاعتبار أن كل لوحة فحص تتطلب 12.5 ml من معلق الخلايا.
4. اختياري: أضف uridine إلى وسط الزرع بتركيز 20 μg/ml.
   ملاحظة: عند فحص المكتبات الكيميائية للبحث عن مثبطات التكاثر الفيروسي، يتبين أنه يتم عزل مركبات تستهدف الخطوات المبكرة من مسار الاصطناع الحيوي للبيريميدين بشكل متكرر. تُستخدم إضافة uridine إلى وسط الزرع لتنقية هذه الجزيئات المضادة للفيروسات؛ حيث تؤدي هذه الإضافة إلى استعادة التكاثر الفيروسي بكفاءة عندما يتم حظر الإنزيمات الموجودة في بداية مسار الاصطناع الحيوي للبيريميدين.
5. احتفظ بنسبة 1:10 من معلق الخلايا لآبار التحكم التي تحتوي على خلايا غير مصابة، ثم انتقل إلى عملية الإصابة بالحجم المتبقي.
6. أذب الحجم المناسب من المحلول المخزون rMV2/Luc. عادةً ما تكون المحاليل المخزونة لـ MV بتركيز 10⁶-10⁸ جسيم معدٍ لكل مل. يجب إصابة المزرعة بـ 0.1 جسيم معدٍ من rMV2/Luc لكل خلية مستهدفة، وهو ما يتوافق مع تعدد عدوى (MOI) مقداره 0.1. 
   ملاحظة: rMV2/Luc مشتق من لقاح MV (سلالة Schwarz) ويتم التعامل معه في بيئة مستوى السلامة البيولوجية الثاني (BSL2).
7. أضف الفيروس إلى معلق الخلايا واخلطه بلطف. انقل الخلايا المصابة إلى حوض توزيع، ووزع 100 μl من معلق الخلايا المصابة في الأعمدة من 2 إلى 11 من ألواح D2 التي تحتوي على المركبات الكيميائية المضافة. يتم خلط معلق الخلايا داخل الحوض بلطف وبشكل منتظم.
8. في العمودين 1 و12، وزع 100 μl من الخلايا غير المصابة في كل بئر. يتم توزيع الخلايا المصابة في الآبار الأخرى.
9. حضن الخلايا لمدة 24 ساعة عند 37 °C و5% CO₂.

2. الفرز الثانوي لتقييم السمية والنشاط المضاد للفيروسات واسع النطاق

1. قم بإجراء تخفيفات تسلسلية بنسبة 1:2 لكل مركب ناجح في ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO)، بدءاً من 500 µM وصولاً إلى 4 µM (8 تخفيفات). املأ أطباق زراعة الأنسجة البيضاء ذات الرموز الشريطية بـ 50 µl من وسط الزراعة. أضف 1 µl من كل تخفيف للمركبات في آبار الزراعة. كرر العملية مرتين للحصول على 3 أطباق زراعة تحتوي على تخفيفات تسلسلية مكررة لكل مركب ناجح.
2. حضّر 37.5 ml من معلق خلايا HEK-293T بتركيز 6 x 10⁵ خلية/ml في وسط الزراعة كما هو موضح أعلاه (في 1.1 و 1.2). وزع 12.5 ml مرتين في أنابيب Falcon واصِب الخلايا إما بفيروس rMV2/Luc عند MOI = 0.1 أو فيروس شيكونغونيا المؤتلف (CHIKV) الذي يعبر عن لوسيفيراز رينيلا (CHIKV/Ren) عند MOI = 0.2. اخلط عن طريق القلب.
   ملاحظة: يشتق CHIKV/Ren من سلالة برية من CHIKV، وبالتالي يجب التعامل معه في بيئة BSL3. يمكن نقل الأطباق من BSL3 إلى BSL1 بمجرد إضافة ركيزة رينيلا إلى آبار الزراعة (انظر أدناه).
3. وزع 50 µl من الخلايا غير المصابة، أو المصابة بـ rMV2/Luc، أو المصابة بـ CHIKV/Ren في أطباق الزراعة التي تحتوي على التخفيفات التسلسلية للمركبات الناجحة. قم بالتحضين لمدة 24 ساعة عند 37 °C.
4. أضف 50 µl من ركيزة لوسيفيراز اليراعة لتحديد نشاط لوسيفيراز اليراعة في الآبار المصابة بـ rMV2/Luc. أضف 50 µl من ركيزة لوسيفيراز رينيلا لتحديد نشاط لوسيفيراز رينيلا في الآبار المصابة بـ CHIKV/Ren. أخيراً، أضف 50 µl من كاشف مقايسة الحيوية القائم على اللوسيفيراز إلى الخلايا غير المصابة لتحديد الحيوية الخلوية.
5. مثل البيانات بيانياً (الشكل 1) وحدد تركيزات المركبات الناجحة التي تثبط تضاعف MV و CHIKV بنسبة 50%. استبعد أي مركب يظهر بعض السمية في هذه المقايسة.

النتائج

الشكل 1. النشاط المضاد للفيروسات والسمية للاستجابة للجرعة للمركبات C864 وC648 وC062. (أ) تم إصابة خلايا HEK-293T بسلالة rMV2/Luc من فيروس الحصبة MV التي تعبر عن لوسيفيراز (MOI=0.1)، وحُضنت مع جرعات متزايدة من C864 أو C648 أو C062 أو DMSO وحده. بعد 24 ساعة، تم تحديد تعبير اللوسيفيراز. تشير العلامة * إلى أن تثبيطات اللوسيفيراز الملحوظة كانت ذات دلالة إحصائية مع المركبات الثلاثة جميعها (p-values < 0.05). (ب) تم إصابة خلايا HEK-293T بسلالة CHIKV/Ren من فيروس chikungunya CHIKV التي تعبر عن لوسيفيراز Renilla (MOI=0.2)، وحُضنت مع جرعات متزايدة من C864 أو C648 أو C062 أو DMSO وحده. بعد 24 ساعة، تم تحديد تعبير لوسيفيراز Renilla. تشير العلامة * إلى تثبيطات ذات دلالة إحصائية مع المركبات الثلاثة جميعها (p-values < 0.05). (ج) تم تحضين خلايا HEK-293T مع جرعات متزايدة من C864 أو C648 أو C062 أو DMSO وحده. وكعنصر تحكم في السمية، تم تدعيم المزارع الخلوية بـ 2.5 μl من محلول IGEPAL بتركيز 0.5%. بعد 24 ساعة، تم تحديد عدد الخلايا الحية باستخدام مقايسة الحيوية المعتمدة على اللوسيفيراز.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
منصة Freedom EVO	TECAN		منصة روبوتية
أطباق زراعة خلايا ميكروية من البوليسترين بـ 96 بئراً، بيضاء	Greiner Bio One	655083
مقايسة CellTiter-Glo المضيئة لحيوية الخلايا	Promega	G7570	مقايسة حيوية تعتمد على اللوسيفيراز
نظام مقايسة اللوسيفيراز Bright-Glo	Promega	E2610	كاشف يحتوي على ركيزة لوسيفيراز اليراعات
نظام مقايسة اللوسيفيراز Renilla-Glo	Promega	E2710	كاشف يحتوي على ركيزة لوسيفيراز رينيلا
نظام مقايسة الجين المراسل Britelite plus	Perkin-Elmer	6016761	كاشف يحتوي على ركيزة لوسيفيراز اليراعات. يمكن استخدامه كبديل لكاشف Bright-Glo لتحديد نشاط اللوسيفيراز.