عزل فيروس عملاق واحد من مجموعة فيروسية مختلطة باستخدام الأميبا

الملخص

المصدر: Sahmi-Bounsiar, D. et al. الشفط الدقيق للخلية الواحدة كاستراتيجية بديلة لفرز الخلايا المنشط بالفلورة لفصل خليط من الفيروسات العملاقة. J. Vis. Exp. (2019)

يوضح هذا الفيديو عملية السحب الدقيق لخلية واحدة لعزل وتكثير مجموعة واحدة من الفيروسات العملاقة من مجموعة فيروسية مختلطة باستخدام الأميبات كخلايا مضيفة.

البروتوكول

1. زراعة الأميبا

1. استخدام Vermamoeba vermiformis (سلالة CDC19) كدعامة خلوية.
2. إضافة 30 mL من وسط مستخلص البروتياز-الببتون-الخميرة-الجلوكوز (PYG) (الجدول 1) و3 mL من الأميبا بتركيز 1 x 10⁶ cells/mL في قارورة زراعة خلوية بمساحة 75 cm².
3. الحفاظ على المزرعة عند درجة حرارة 28 °C.
4. بعد 48 h، يتم تقدير كمية الأميبا باستخدام شرائح العد.
5. للشطف، تُجمع الخلايا بتركيز 1 x 10⁶ cells/mL ويتم تجميع الأميبا في كريّة عن طريق الطرد المركزي عند 720 x g لمدة 10 min. يتم إزالة السائل الطافي وإعادة تعليق الكريّة في الحجم المناسب من وسط التجويع للحصول على تركيز 1 x 10⁶ cells/mL (الجدول 1).

2. التخفيف النهائي

1. أجرِ تخفيفًا تسلسليًا (من 10^-1 إلى 10^-11) للعينة الفيروسية في وسط تجويع (الجدول 1).
2. لقّح 2 mL من 1 x 10⁶ Vermamoeba vermiformis في كل طبق بتري باستخدام 100 µL من اللقاح المختلط.
3. ضع أطباق بتري في كيس بلاستيكي قابل للإغلاق عند درجة حرارة 30 °C.
4. ابدأ بمراقبة أطباق بتري باستخدام المجهر الضوئي المقلوب بعد 6 h من العدوى، وافحص مورفولوجيا الخلايا كل 4 إلى 8 h.
5. عند ظهور التأثير الممرض للخلايا الذي يتميز باستدارة الخلايا، ابدأ عملية الشفط الدقيق للخلية الواحدة.

3. الشفط الدقيق للخلية الواحدة

1. تجهيز المضيف
   ملاحظة: يتم هذا التجهيز لتحرير الخلايا المفردة المصابة إلى دعامة خلوية جديدة.
   1. عالج الأميبا في المزرعة باستخدام عامل مضاد للميكروبات يحتوي على 10 µg/mL من vancomycin، و10 µg/mL من imipenem، و20 µg/mL من ciprofloxacin، و20 µg/mL من doxycycline، و20 µg/mL من voriconazole. يُستخدم هذا المزيج لتجنب التلوث البكتيري والفطري.
      ملاحظة: تتم هذه العملية على طاولة عمل خارج محطة السلامة الميكروبيولوجية. أضف 2 mL من الأميبا بتركيز 1 x 10⁶ cells/mL في كل طبق من أطباق بيتري الـ 15. ولضمان التصاق الأميبا، قم بتحضين المزرعة عند 30 °C لمدة 30 min.
2. اختر طبق بيتري المستخدم لعملية السحب المجهري من التخفيف الحدّي وفقاً للمعايير التالية: 1) عدم وجود أي تلوث مرئي بعوامل فطرية وبكتيرية، 2) وجود دليل على التأثير المرضي الخلوي للأميبا بسبب الفيروسات، 3) مرحلة التحلل المسبق والاستدارة للأميبا (لتجنب سحب الجسيمات الفيروسية).
3. قم بإعداد محطة عمل تحتوي على المواد التالية (الشكل 1A,B): المتلاعب المجهري (Micromanipulator)، والذي يسمح بتحديد موضع الشعيرة المجهرية؛ جهاز التحكم اليدوي في الضغط، المستخدم لسحب الخلايا وتحريرها داخل الشعيرة المجهرية؛ مجهر مقلوب؛ وحدات محرك "وصل وشغل" (Plug and play)؛ كاميرا؛ وحدة حاسوب لمعاينة عملية التلاعب والتقاط الصور.
4. اختر شعيرة مجهرية (الشكل 1C).
   ملاحظة: يمكن أن يؤثر حجم الخلايا، وتشوه والتصاق أغشيتها بالأسطح، والحركية الخلوية على سير عملية السحب المجهري بسلاسة. يمكن اختيار قطر الشعيرة المجهرية بدقة وتكييفه مع أنواع محددة من الخلايا بناءً على أحجامها وطرق سحبها. تم استخدام شعيرة مجهرية بقطر داخلي 20 µm لسحب أميبا مستديرة (قطرها ~10 µm). وهذا يسمح بالحفاظ على موضع داخلي وتحرير الخلية بسهولة.
5. تركيب النظام.
   1. ثبّت زاوية تشغيل نظام القبض على الوحدة الآلية عند 45°.
   2. قم بإجراء تركيب مزدوج، أولاً على نظام القبض، ثم على الشعيرة المجهرية.
   3. قم بضبط التركيز على الخلايا بعد تمرير بضع قطرات من الزيت عبر الشعيرة المجهرية.
      ملاحظة: يتم توفير الزيت المعدني المتوافق بيولوجياً بواسطة الجهاز.
   4. أكمل عملية التركيب وفقاً لتوصيات الشركة المصنعة.
6. استنساخ الخلايا (الشكل 2A,B)
   1. ضع طبق بيتري الذي يحتوي على 2 mL من الأميبا المصابة تحت المجهر.
   2. قم بضبط التركيز أولاً على الخلايا، ثم على الشعيرة المجهرية المغمورة في المزرعة.
   3. اختر خلية مفردة مستديرة وقرّب الشعيرة المجهرية باستخدام المتلاعب المجهري.
   4. قم بإجراء سحب خفيف باستخدام التحكم اليدوي في الضغط على الخلية، لسحبها إلى داخل الشعيرة المجهرية. انقل الخلية المفردة من العينة الأولى وحررها في الدعامة الخلوية، ثم قم بتحضينها عند 30 °C.
   5. أجرِ ملاحظات يومية باستخدام مجهر بصري مقلوب لمراقبة مظهر الخلايا ومتابعة ظهور التأثير المرضي الخلوي.

الجدول 1: تركيب أوساط الزراعة

النتائج

الشكل 1: مواد التلاعب الدقيق. (A) الإعداد الفعلي لمحطة العمل. (B) توضيح تخطيطي لمكونات محطة العمل. (C) توضيح تخطيطي للأنبوبة الشعرية الدقيقة.

الشكل 2: خطوات الشفط الدقيق. (A) إجراء عزل الخلية الواحدة (تكبير x40). (B) توضيح تخطيطي للخطوات المختلفة لشفط الخلية الواحدة: 1) تحديد موقع الخلية. 2) شفط الخلية. 3) خطوة التحرير. تشير الأسهم السوداء إلى الأنبوب الشعري الدقيق وتشير الأسهم البيضاء إلى الخلية الواحدة.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
Corning cell culture flasks 150 cm²	Sigma-aldrich	CLS430825	الاستزراع
Corning cell culture flasks 25 cm²	Sigma-aldrich	CLS430639	الاستزراع
Corning cell culture flasks 75 cm²	Sigma-aldrich	CLS430641	الاستزراع
DFC 425C camera	LEICA	Unkown	الملاحظة/المراقبة
Eclipse TE2000-S Inverted Microscope	Nikon	Unkown	الملاحظة/المراقبة
Microcapillary 20 µm	Eppendorf	5175 107.004	الشفط المجهري وتحرير الخلايا
Micromanipulator InjectMan NI2	Eppendorf	631-0210	تحديد موضع الأنبوب الشعري المجهري
Petri dish 35 mm	Ibidi	81158	الاستزراع/الملاحظة