فرز جزيئات الفيروسات الفردية القائم على الفلورة للتحليل الجينومي

الملخص

المصدر: Zeigler Allen, L., et al. عزل وتحليل جينوم الفيريونات المفردة باستخدام "علم جينوم الفيروس المفرد". J. Vis. Exp. (2013).

يوضح هذا الفيديو كيف يتيح قياس التدفق الخلوي عزل الفيروسات الفردية التي تحتوي على جينوم من مجموعات مختلطة، وذلك من خلال الكشف القائم على الفلورة والفرز الدقيق للجسيمات، متبوعاً بالتضمين في الآغاروز من أجل التوصيف الجينومي اللاحق.

البروتوكول

1. تحضير المعلقات الفيروسية

قبل عزل الفيريونات المنفردة عبر قياس التدفق الخلوي، قم بتحضير معلقات فيروسية غير مثبتة.

1. اعزل الجسيمات الفيروسية باستخدام بروتوكولات محددة مسبقاً، مع التأكد من أن المعلق الفيروسي النهائي موجود في محلول TE (Tris-EDTA، pH 8) مرشح بمرشح 0.1 μm. ونوصي باستخدام مناهج الترشيح بالتدفق المماسي (TFF)، رغم تطوير طرق أخرى تعتمد على التنديف الكيميائي.
2. قم بتعداد الجسيمات الفيروسية باستخدام بروتوكولات معتمدة، على سبيل المثال باستخدام المجهر الفلوري (epifluorescence 8-10) أو قياس التدفق الخلوي.
3. قسم المعلق الفيروسي إلى أجزاء متساوية في أنبوبي Eppendorf (يوصى بأن يكون الحجم النهائي 1,000 μl).

2. قياس التدفق الخلوي

1. لفرز الفيروسات باستخدام جهاز قياس التدفق الخلوي BD FACSAria II المجهز بمضاعف فوتوني للتشتت الأمامي مخصص (FSC PMT)، خفف الجسيمات الفيروسية في محلول TE المرشح بمرشح 0.1 μm وبدرجة pH 8.0 إلى عيار مناسب لتحقيق معدل أحداث يبلغ 200 events sec^-1.
2. اضبط العتبات لزيادة نسب الإشارة إلى الضوضاء؛ فعلى سبيل المثال، بالنسبة لتجمع مختلط يحتوي على جسيمات عاثيات T4 وlambda، يوصى بما يلي: ضبط FSC PMT عند 1,000 وSSC عند 200.
3. قم بتشغيل 100 μl من عينات "فارغة" تحتوي فقط على 1) محلول TE المرشح بمرشح 0.1 μm، و2) محلول TE المرشح بمرشح 0.1 μm مع SybrGreen1 بتخفيف 1e-4 من المخزون (10,000X).
4. قم بتشغيل جزء صغير (يوصى بـ 100 μl) من معلق فيروسي غير مصبغ لتقييم الخلفية، يليه المعلق الفيروسي المصبوغ (SybrGreen1 بتخفيف 1e-4 من المخزون)، مع تحليل الجسيمات الفيروسية حتى يصل إجمالي الأحداث إلى 5,000 لكل منها. يهدف ذلك إلى التحقق من التركيز وضبط بوابات الفرز، إذا لزم الأمر، قبل البدء في الفرز. ونوصي باستخدام بوابة ضيقة في مركز الجسيمات الفيروسية. كما نستخدم مخطط SYBR Green وFSC PMT لإنشاء البوابات.
5. أضف 5 μl من أغاروز منخفض درجة الانصهار (LMP) بتركيز 1% (في محلول TBE المنظم) مبرد إلى 37 °C إلى كل بئر في شريحة مجهرية من البوليتيترافلوروإيثيلين (PTFE) (Electron Microscopy Sciences).
6. ضع الشريحة المجهرية PTFE في جهاز قياس التدفق الخلوي لالتقاط الجسيمات الفيروسية المفرزة.
7. ابدأ فرز الجسيمات الفيروسية المصبوغة بـ SYBR green مباشرة على شريحة PTFE التي تحتوي على أغاروز LMP. نوصي بفرز 10 أحداث (جسيمات فيروسية) أو أكثر في بعض الآبار للمساعدة في تحديد عمق الفيروسات أثناء الفحص بالمجهر البؤري الماسح بالليزر (CSLM).
8. عند اكتمال الفرز، أخرج الشريحة من جهاز قياس التدفق الخلوي وأضف 5 μl إضافية من أغاروز LMP المبرد إلى 37 °C إلى كل بئر، وبذلك يتم تغليف الجسيم (أو الجسيمات) الفيروسية.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
منظم 1X TE	Invitrogen	12090-015
فينول مشبع بالمنظم	Invitrogen	15513-039
أجاروز LMP	Invitrogen	16520100
شريحة مجهر PTFE	Electron Microscopy Sciences	63430-04	24 بئر، قطر 4 mm
β-agarase	New England Biolabs	M0392S