إثراء الفيروسات العملاقة باستخدام الأميبا من عينة مياه بيئية

الملخص

المصدر: Bou Khalil, J. Y.,et al. استراتيجية سريعة لعزل فيروسات Faustoviruses جديدة من عينات بيئية باستخدام Vermamoeba vermiformis. J. Vis. Exp. (2016)

يوضح هذا الفيديو عملية إثراء الفيروسات العملاقة من عينة مياه بيئية باستخدام الزراعة المشتركة القائمة على الأميبا، وذلك لتمكين عمليات الكشف والتحليل اللاحقة.

البروتوكول

1. جمع العينات

1. اجمع 70 عينة من بيئات ومناطق مختلفة. في هذه الحالة، استخدم ما يلي: 5 عينات من المياه الملوثة من قرية Saint Pierre de Meyzoargues (فرنسا)، و15 عينة من البحيرة في Parc Borély في Marseille (فرنسا)؛ و15 عينة من مياه البحر مع الرواسب من المداخل الصخرية في Samena في Marseille (فرنسا)، و25 عينة من مياه الأنهار من جبال الألب (فرنسا)، وأخيراً، 10 عينات من مياه الصرف الصحي في La Ciotat (فرنسا).
2. قم بمعالجة العينات بجهاز Vortex لضمان التجانس قبل التلقيح، لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة دون أي معالجة مسبقة.

2. إجراء العزل

1. تحضير المضيف لإجراءات المزرعة العمياء وتلقيح العينات
   1. استخدم Vermamoeba vermiformis (السلالة CDC19) كدعامة خلوية للمزرعة المشتركة.
   2. حافظ على الأميبا عند 28 °C، في قارورة زراعة خلايا بمساحة 75 cm² تحتوي على 30 ml من وسط البروتياز-ببتون-مستخلص الخميرة-الجلوكوز (PYG). يرجى مراجعة تركيب وسط PYG في الجدول 1.
      ملاحظة: بعد 48 hr، يتم تقدير كمية الأميبا عن طريق العد العادي باستخدام شرائح العد (مثل Kovaslides).
   3. احصد الخلايا بتركيز يتراوح من 5 x 10⁵ إلى 10⁶ خلية/مل، وقم بترسيب الأميبا عن طريق الطرد المركزي عند 720 x g لمدة 10 min.
   4. أزل الطافي عن طريق الشفط، وأعد تعليق راسب الأميبا في 30 ml من محلول ملحي للأميبا (PAS) المعقم الجدول 1. كرر عملية الشطف هذه.
   5. أعد تعليق الأميبا في 30 ml من وسط التجويع مع خليط من المضادات الحيوية ومضادات الفطريات بتركيز تقريبي يبلغ 10⁶ أميبا/مل. وسط التجويع هو وسط بقاء للأميبا، يتيح لها البقاء على قيد الحياة دون تكيس أو تكاثر. راجع التركيب في الجدول 1.
      ملاحظة: احتوى خليط العوامل المضادة للميكروبات على 10 µg/ml vancomycin، و10 µg/ml imipenem، و20 µg/ml ciprofloxacin، و20 µg/ml doxycycline، و20 µg/ml voriconazole. عمل هذا الخليط على تقليل التلوث البكتيري والفطري الذي يمكن أن يقلل من التكاثر الفيروسي أو يغيره.
   6. لقّح مباشرة 25 µl من كل عينة فوق طبقة أحادية من الأميبا بحجم 200 µl في طبق ذو 96 بئر وقاع مسطح لتعزيز التصاق الأميبا، واحضنها عند 30 °C في بيئة رطبة (تتمثل البيئة الرطبة في وضع كمادة مبللة داخل الكيس الذي يحتوي على الطبق لتجنب التبخر). هذه هي المزرعة الأولية. اترك بئرين من الأميبا دون تلقيح بأي عينة؛ لتعمل كمجموعة ضابطة سالبة. احضن هذه المزرعة الأولية لمدة ثلاثة أيام.
   7. بعد ثلاثة أيام من التلقيح الأول، قم بإجراء مزرعة فرعية من طبق المزرعة الأولية على أميبا طازجة كما هو موضح أعلاه دون أي فحص مجهري. احضن الطبق الجديد لمدة ثلاثة أيام تحت نفس ظروف المزرعة الأولية.
   8. قم بإجراء المزرعة النهائية بعد أيام الحضن الثلاثة هذه بنفس طريقة المزرعة الأولية والفرعية. احضن المزرعة النهائية لمدة يومين، ثم انتقل إلى مرحلة الكشف.

الجدول 1. وصفات المحاليل

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
وسط البروتياز والبيبتون ومستخلص الخميرة والجلوكوز (PYG)، ومحلول بيج الملحي للأميبا (PAS)، ووسط التجويع	إنتاج مختبري داخلي	Marseille URMITE	x
سلالة الأميبا CDC-19	ATCC	France	50237
أطباق	Cellstar	France	655180
دوارق	SARSTEDT	Germany	833911
جهاز طرد مركزي فائق Sorval WX 80	Thermo scientific	France	9102448