تحديد كمية فيروس التهاب الكبد C المعدي باستخدام المجهر الفلوري

الملخص

المصدر: Ren, S., et al. بروتوكول لتحليل تضاعف فيروس التهاب الكبد C. J. Vis. Exp. (2014)

يوضح هذا الفيديو مقايسة البؤر الفلورية المستخدمة لتقدير كمية فيروس التهاب الكبد C المعدي في المزرعة الخلوية. كما يوضح التخفيف التسلسلي للطافي الفيروسي، وإصابة خلايا الورم الكبدي، والكشف عن مواقع التضاعف الفيروسي باستخدام المجهر الفلوري القائم على الأجسام المضادة.

البروتوكول

1. قياس عيار الفيروس

1. قم بزراعة خلايا Huh-7.5.1 الساذجة بكثافة تقريبية تبلغ 3 × 10³ خلية/بئر باستخدام طبق ذي 96 بئراً. وفي اليوم التالي، تُجرى تخفيفات تسلسلية بمقدار 10 أضعاف للسائل الطافي للمزرعة الخالي من الخلايا والمستخلص من خلايا منقول إليها الحمض النووي الريبوزي (RNA) لفيروس التهاب الكبد C (HCV) باستخدام أوساط النمو، ثم تُلقح في ثلاث مكررات على خلايا Huh-7.5.1.
2. ثبّت الخلايا بعد 72 ساعة من العدوى باستخدام الميثانول (لمدة 30 دقيقة عند -20 ºج) وإجراء صبغ مناعي لبروتين NS5A الخاص بفيروس التهاب الكبد C.
3. اغسل الخلايا بمحلول PBS ثلاث مرات، ثم قم بعملية الحجب باستخدام محلول IFA blocking buffer.
4. استخدم جسماً مضاداً أولياً متعدد النسائل من الأرانب مضاداً لـ NS5A أو جسماً مضاداً أحادي النسيلة من الفئران مضاداً لـ dsRNA من النوع J2 بتخفيف 1:200 (1 μg/ml) وتحضينها لمدة تتراوح من 5 ساعات إلى ليلة كاملة عند درجة حرارة 4 ºج.
5. اغسل الخلايا بمحلول PBS ثلاث مرات بعد إضافة الجسم المضاد الأولي.
6. أضف جسماً مضاداً ثانوياً متعدد النسائل من الماعز مضاد لـ IgG-488 للأرانب، أو جسماً مضاداً ثانوياً متعدد النسائل من الماعز مضاد لـ IgG-594 للفئران، بتخفيف 1:1,000 (1 μg/ml) وتحضينها لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
7. اغسل الخلايا بمحلول PBS ثلاث مرات، ثم افحصها باستخدام مجهر فلوري.
8. استخدم أعلى تخفيف لحساب البؤر الموجبة لبروتين NS5A وحساب متوسط عدد الوحدات المكونة للبؤر (FFU) لكل مليلتر. انظر الشكل 1 لمعايرة فيروس HCV.

النتائج

الشكل 1. فحص قدرة فيروس HCV من النوع البري على العدوى وقياس عيار الفيروس. أ) استُخدمت خلايا Huh-7.5.1 الساذجة لدراسات العدوى. خضع الطافي الخالي من الخلايا، الذي جُمِع بعد 48 و96 ساعة من عملية ترانسفكشن (hpt) لـ HCV RNA، لتخفيفات تسلسلية بمقدار 10 أضعاف وأُضيف إلى الخلايا في طبق مكون من 96 بئراً في ثلاث مكررات. وبعد 72 ساعة من العدوى، تم تثبيت الخلايا وصبغها مناعياً لبروتين HCV NS5A. وتعتبر الخلايا ذات الصبغ الإيجابي لـ NS5A (باللون الأحمر) مصابة بالفيروس. ولتقييم وحدة تشكيل البؤر (FFU)، تم عد البؤر الإيجابية عند أعلى تخفيف. وتظهر في الشكل لوحات صور تمثيلية (شريط المقياس 100 μm). ب) يوضح الرسم البياني القيم المتوسطة والانحرافات المعيارية لعيار الفيروس بوحدات FFU لكل مليلتر. لم ينتج الطافر المفتقر للبوليميراز جسيمات معدية. WT: النوع البري؛ Pol-: المفتقر للبوليميراز.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
وسط دولبيكو المعدل إيجل (DMEM)	Fisher Scientific	10-017-CV
Huh-7.5.1	معهد سكريبس للأبحاث		تم توفير الخط الخلوي مشكوراً من الدكتور Francis Chisari إلى الدكتور Arumugaswami بموجب اتفاقية نقل مواد (MTA) مبرمة بين معهد The Scripps Research Institute ومركز Cedars-Sinai Medical Center الطبي.
جسم مضاد أحادي النسيلة من الفأر مضاد لـ dsRNA J2	الإنجليزية & Scientific Consulting Kft.	10010200
جسم مضاد ثانوي من الماعز مضاد لـ IgG الأرنب Alexa Fluor 488	Life Technologies	A11008
جسم مضاد ثانوي من الماعز مضاد لـ IgG الأرنب Alexa Fluor 594	Life Technologies	A11020