تصوير الكبح النسخي في الخلايا المصابة بالفيروسات

الملخص

المصدر: Kalveram, B. et al. استخدام كيمياء النقرة (Click Chemistry) لقياس تأثير العدوى الفيروسية على تخليق الحمض النووي الريبي (RNA) في الخلية المضيفة. J. Vis. Exp. (2013)

يوضح هذا الفيديو استخدام كيمياء النقر والمجهر الفلوري لتصور عملية نسخ الـ RNA الناشئ في خلايا الثدييات. ويسلط الضوء على كيفية قيام العدوى الفيروسية بتثبيط عملية النسخ في الخلية المضيفة من خلال مقارنة الإشارات الفلورية بين الخلايا المصابة والخلايا الضابطة.

البروتوكول

1. إصابة الخلايا بفيروس حمى الوادي المتصدع (RVFV) سلالة MP-12 ووسم الحمض النووي الريبوزي (RNA) الناشئ باستخدام 5-إيثينيل يوريدين (EU)

   1. زراعة خلايا الكلية الجنينية البشرية 293 (HEK293) في طبق زراعة أنسجة مكون من 6 آبار في وسط نمو (وسط دولبكو المعدل Eagle (DMEM) يحتوي على 10% مصل جنين بقري، و100 U/mL بنسلين، و100 μg/mL ستريبتومايسين). تُحضن الخلايا في حضانة رطبة عند 37 °C و5% CO₂ حتى تصل الخلايا إلى درجة تلاقي تتراوح بين 80 - 100%.
   2. إصابة الخلايا بسلالة MP-12 بمعدل إصابة (MOI) قدره 3. يجب تضمين بئرين غير مصابين على الأقل: سيعمل أحدهما كضابط غير مصاب، بينما يُعالج الآخر بالأكتينومايسين D (ActD). يُزال وسط النمو ويُخفف المخزون الفيروسي بحيث يكون الحجم الإجمالي المضاف إلى كل بئر 400 μL. تُحضن الخلايا لمدة ساعة واحدة في حضانة رطبة عند 37 °C و5% CO₂.
   3. إزالة اللقاح وإضافة 2 mL من وسط نمو طازج لكل بئر. تُحضن الخلايا عند 37 °C لمدة 12 ساعة.

   ملاحظة: عند تكييف هذا البروتوكول للاستخدام مع فيروس آخر، يُنصح بإجراء تجربة تتبع زمني لتحديد النقطة الزمنية المثلى للوسم والحصاد. يتم إعداد هذا التتبع الزمني بحيث تكون أوقات الإصابة متدرجة وبحيث يمكن وسم جميع العينات وحصادها وصبغها في الوقت ذاته.

   4. بعد 12 ساعة من الإصابة (hpi)، يُستبدل وسط النمو بوسط يحتوي على 0.5 mM EU. ويُضاف أيضاً 5 μg/mL ActD إلى أحد الآبار غير المصابة؛ حيث سيعمل هذا كضابط لتثبيط النسخ، لأن ActD يثبط تخليق RNA المعتمد على DNA. تُعاد الخلايا إلى الحضانة.
   5. بعد 13 ساعة من الإصابة (hpi)، تُغسل الخلايا مرة واحدة بمحلول ملحي منظم بالفوسفات (PBS) وتُحصد عن طريق التريبسين. تُغسل الخلايا المحصودة ثلاث مرات بمحلول PBS يحتوي على 1 mM حمض إيثيلين ثنائي أمين رباعي الخليك (EDTA).

   ملاحظة: خلال هذه الخطوة والخطوات اللاحقة، لا تقم بطرد الخلايا مركزياً بسرعة تزيد عن 500-1,000 x g لمنع تكسر الخلايا. تُطرد الخلايا مركزياً لمدة 1-2 دقيقة للترسيب.

   ملاحظة: إذا كان من المخطط إجراء صبغ مناعي سطحي بعد تفاعل الكليك، يتم الحصاد باستخدام ماسح خلايا مطاطي أو كاشط خلايا مخصص للاستخدام مرة واحدة بدلاً من ذلك.

   6. تثبيت الخلايا عن طريق إعادة تعليقها في 1 mL من بارافورمالدهيد (PFA) بنسبة 4%، وتُحضن لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT).
   7. تُغسل الخلايا مرة واحدة بـ 1 mL PBS-EDTA لكل بئر. انتقل فوراً إلى الخطوة 2.

   ملاحظة: من المهم المباشرة فوراً بتفاعل الكليك، لأن RNA يتحلل إذا تُرِك في هذه المرحلة لفترات طويلة. وبالمثل، عند إجراء تجربة تتبع زمني، تأكد من وسم وتثبيت وصبغ جميع العينات في الوقت ذاته.

2. تفاعل الكليك للكشف عن RNA الموُسم

   1. نفاذية الخلايا عن طريق إضافة 1 ml Triton X-100 بنسبة 0.2% في PBS. تُحضن لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT).

   ملاحظة: يجب أن تكون جميع المحاليل المستخدمة في الخطوات من 2.1 إلى 2.3 خالية من النيوكلياز.

   2. الغسل ثلاث مرات بـ 1 ml PBS لكل بئر.
   3. إزالة الأغطية الزجاجية من الطبق المكون من 12 بئراً ونقلها إلى غرفة رطبة. يُغطى كل غطاء زجاجي بـ 50 - 100 μl من محلول صبغ الكليك (100 mM Tris pH 8.5، و1 mM CuSO₄، و20 μM أزيد فلوري [الحد الأقصى للإثارة/الانبعاث: 590/617 nm]، و100 mM حمض الأسكوربيك). تُحضن لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة (RT) وفي الظلام.

   ملاحظة: لتجهيز الغرفة الرطبة، تُبطن قاعدة طبق زراعة الخلايا أو طبق بتري بقطر 10 سم بفيلم البارافين البلاستيكي. تُبطن الحافة الداخلية للطبق بمناشف ورقية مبللة. تُوضع الأغطية الزجاجية فوق فيلم البارافين البلاستيكي.

   ملاحظة: يجب الحرص على عدم جفاف الأغطية الزجاجية خلال هذه الخطوة أو أي خطوة أخرى في البروتوكول. من الأفضل إضافة محلول الصبغ إلى كل غطاء زجاجي مباشرة بعد وضعه في الغرفة الرطبة.

   ملاحظة: يتم تحضير محلول صبغ الكليك طازجاً قبل هذه الخطوة مباشرة. يمكن تخزين المحاليل المخزنة من 1.5 M Tris pH 8.5، و100 mM CuSO₄، و500 mM حمض الأسكوربيك عند 4 °C. ومع ذلك، يجب التخلص من أي محلول مخزن من حمض الأسكوربيك تحول لونه إلى الأصفر.

   ملاحظة: تأكد من اختيار فلوروفور يتوافق مع المرشحات الموجودة في المجهر الفلوري الخاص بك.

   4. إزالة الأغطية الزجاجية من الغرفة الرطبة ووضعها في طبق جديد مكون من 12 بئراً، والغسل ثلاث مرات بـ 1 ml PBS لكل بئر.
   5. تركيب الأغطية الزجاجية عن طريق وضع قطرة واحدة (حوالي 15 μl) من Fluoromount-G على شريحة مجهرية. يتم غمس الغطاء الزجاجي في H₂O، وإزالة H₂O الزائد بلمس الجانب بمنشفة ورقية، ثم يُوضع بحيث يكون جانب الخلايا لأسفل في قطرة Fluoromount-G. يُترك ليجف في الهواء لمدة 5 دقائق.

   ملاحظة: عند التصوير باستخدام مجهر مقلوب، يُترك Fluoromount-G ليتصلب عند 4 °C طوال الليل أو يتم تثبيت الأغطية الزجاجية على الشريحة المجهرية عن طريق سد الحافة بطلاء أظافر شفاف.

   ملاحظة: يمكن تصوير الشرائح فوراً أو تخزينها عند 4 °C في الظلام لمدة تصل إلى أسبوع.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
5-Ethynyl uridine	Berry Associates	PY 7563	يُذاب في DMSO لتحضير محلول مخزون بتركيز 100 mM
غطاء شريحة دائري 12-mm	Fisherbrand	12-545-82
Actinomycin D (ActD)	Sigma	9415	يُذاب في DMSO لتحضير محلول مخزون بتركيز 10 mM
مجهر فلوري			مثلاً Olympus IX71
CuSO₄	Sigma	C-8027	يُذاب في H₂O لتحضير محلول مخزون بتركيز 100 mM
DMEM (وسط Dulbecco المعدل من eagle)	Invitrogen	11965092
FBS (مصل جنين البقر)	Invitrogen	16000044
أزيد فلوري (مقترن بـ Alexa Fluor 594)	Invitrogen	A10270
Fluoromount-G	Southern Biotech	0100-01
L-ascorbic acid	Sigma	A-5960	يُذاب في H₂O بتركيز 500 mM
Paraformaldehyde	Sigma	158127
Penicillin-Streptomycin	Invitrogen	15140122
Triton X-100	Sigma	T-8787
Trypsin-EDTA	Invitrogen	25200056
Trizma base	Sigma	T-1503	يُذاب في H₂O لتحضير محلول مخزون بتركيز 1.5 M، pH 8.5