تحليل تثبيط النسخ في الخلية المضيفة الناجم عن الفيروس باستخدام قياس التدفق الخلوي

الملخص

المصدر: Kalveram, B., et al. استخدام كيمياء النقر لقياس تأثير العدوى الفيروسية على تخليق الحمض النووي الريبوزي (RNA) في الخلية المضيفة. J. Vis. Exp. (2013)

يوضح هذا الفيديو استخدام كيمياء النقر (click chemistry) وقياس التدفق الخلوي لقياس تثبيط عملية النسخ في الخلايا المضيفة الناجم عن الإصابة الفيروسية. يتم إصابة خلايا ثديية بفيروس يعبر عن بروتين ضراوة نووي يعمل على تعطيل معقد عوامل النسخ في المضيف، بينما تظل الخلايا الضابطة نشطة من الناحية النسخية. ويؤدي دمج 5-ethynyl uridine إلى وسم mRNA المصنع حديثاً، مما يتيح قياس النشاط النسخي في الخلايا المصابة والخلايا الضابطة من خلال الكشف الفلوري المزدوج.

البروتوكول

1. إصابة الخلايا بفيروس MP-12 ووسم الحمض النووي الريبي (RNA) الناشئ باستخدام 5-ethynyluridine (EU)

1. ازرع خلايا 293 في طبق زراعة أنسجة مكون من 6 آبار في وسط نمو (DMEM يحتوي على 10% مصل بقري جنيني، و 100 U/ml بنسيلين، و 100 μg/ml ستربتومايسين). قم بالتحضين في حضانة رطبة عند 37 °C و 5% CO₂ حتى تصل الخلايا إلى درجة تلاقي تتراوح بين 80 - 100%.
2. أصِب الخلايا بـ MP-12 بمعدل عدوى (m.o.i.) قدره 3. خصص بئريْن غير مصابين على الأقل: سيعمل أحدهما كعينة ضابطة غير مصابة، بينما سيتم معالجة الآخر بـ ActD في الخطوة 1.4. أزل وسط النمو وقم بتخفيف مخزون الفيروس بحيث يكون الحجم الإجمالي المضاف إلى كل بئر 400 μl. قم بالتحضين لمدة ساعة واحدة في حضانة رطبة عند 37 °C و 5% CO₂.
3. أزل اللقاح وأضف 2 ml من وسط نمو طازج لكل بئر. قم بالتحضين عند 37 °C لمدة 12 hr.

ملاحظة: في حال تطويع هذا البروتوكول للاستخدام مع فيروس آخر، يُنصح بإجراء تجربة تتبع زمني لتحديد النقطة الزمنية المثلى للوسم والجمع. قم بإعداد هذا التتبع الزمني بحيث تكون أوقات العدوى متدرجة، مما يسمح بوسم جميع العينات وجمعها وصبغها في الوقت ذاته.

4. عند مرور 12 ساعة بعد العدوى (h.p.i.)، استبدل وسط النمو بوسط يحتوي على 0.5 mM EU. أضف أيضاً 5 μg/ml ActD إلى إحدى الآبار التي خضعت للعدوى الوهمية؛ حيث سيعمل ذلك كعينة ضابطة لتثبيط عملية النسخ، نظراً لأن ActD يثبط تخليق RNA المعتمد على DNA. أعد الخلايا إلى الحاضنة.
5. عند مرور 13 ساعة بعد العدوى (h.p.i.)، اغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام PBS ثم قم بحصادها عن طريق تريپسنة (trypsinization) الخلايا. اغسل الخلايا المحصودة ثلاث مرات باستخدام PBS يحتوي على 1 mM EDTA (PBS-EDTA).

ملاحظة: خلال هذه الخطوة والخطوات اللاحقة، لا تقم بطرد الخلايا مركزياً بسرعة تتجاوز 500 - 1,000 x g لمنع تكسر الخلايا. قم بطرد الخلايا مركزياً لمدة 1-2 min لترسيبها.

ملاحظة: إذا كان من المخطط إجراء صبغ مناعي سطحي بعد تفاعل الكليك، فقم بجمع الخلايا باستخدام ممسحة مطاطية (rubber policeman) أو كاشطة خلايا مخصصة للاستخدام مرة واحدة بدلاً من ذلك.

6. يتم تثبيت الخلايا عن طريق إعادة تعليقها في 1 ml من PFA بتركيز 4% والتحضين لمدة 30 min في درجة حرارة الغرفة (RT).
7. تُغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام 1 ml من PBS-EDTA لكل بئر. ثم يتم الانتقال مباشرة إلى الخطوة 6.

ملاحظة: من المهم المباشرة فوراً بتفاعل النقر (click reaction)، حيث أن الـ RNA يتحلل إذا تُرِك في هذه المرحلة لفترات زمنية طويلة. وبالمثل، عند إجراء تجربة تعتمد على التسلسل الزمني، تأكد من وسم وتثبيت وصبغ جميع العينات في الوقت ذاته.

2. تفاعل كليك للكشف عن الـ RNA المسمى

1. قم بنفاذ الخلايا عن طريق إعادة تعليقها في 0.5 ml من Triton X-100 بتركيز 0.2% في PBS. يتم التحضين لمدة 10 min في درجة حرارة الغرفة RT.

ملاحظة: يجب أن تكون جميع المحاليل المستخدمة في الخطوات 2.1 إلى 2.3 خالية من النوكلياز. إذا لم تترسب الخلايا بشكل صحيح خلال هذه الخطوة، قم بزيادة وقت الطرد المركزي إلى 5 min. سيتحسن سلوك الترسيب بمجرد تعليق الخلايا في FACS buffer.

2. اغسل مرة واحدة باستخدام 1 ml من PBS.

ملاحظة: لا تستخدم EDTA في هذه الخطوة لأن ذلك سيؤدي إلى مخلبة أيونات Cu²⁺ الضرورية لتفاعل الـ click.

3. أعد تعليق الخلايا في 200 μl من محلول صبغ النقر (100 mM Tris pH 8.5، و1 mM CuSO4، و200nM من azide مُعلم بصبغة فلورية [الحد الأقصى للإثارة/الانبعاث: 650/665 nm]، و100 mM حمض الأسكوربيك). تُحضن الخلايا لمدة 1 hr في درجة حرارة الغرفة (RT) وفي الظلام.

ملاحظة: قم بتحضير محلول صبغ الـ click طازجاً مباشرة قبل هذه الخطوة. يمكن تخزين المحاليل المخزونية من 1.5 M Tris pH 8.5، و 100 mM CuSO₄، و 500 mM ascorbic acid عند درجة حرارة 4 °C. ومع ذلك، تخلص من أي محلول مخزوني من ascorbic acid تحول لونه إلى الأصفر. إذا تكتلت الخلايا خلال هذه الخطوة، قم بإعادة تعليقها عن طريق السحب والضخ بالماصة عدة مرات. تأكد من اختيار فلوروفور يمكن اكتشافه بواسطة جهاز قياس التدفق الخلوي الخاص بك. قم أيضاً بتحضير عينة واحدة من الخلايا المصابة التي لا تخضع لإجراء صبغ الـ click؛ حيث ستكون هذه العينات مطلوبة لمعايرة جهاز قياس التدفق الخلوي. إما أن تستخدم نصف الخلايا المصابة أو تخصص بئراً إضافياً من الخلايا المصابة في الخطوة 1.2.

يُغسل مرتين باستخدام محلول FACS المنظم (PBS يحتوي على 1 mM EDTA و 0.5% (w/v) BSA).

3. التألق المناعي للكشف عن تعبير البروتينات الفيروسية

1. أعد تعليق الخلايا في 200 μl من الجسم المضاد الأولي (anti-RVFV) المخفف في FACS buffer بنسبة (1:10,000)، ثم حضنها لمدة 1 hr في درجة حرارة الغرفة (RT) في الظلام.

ملاحظة: بدلاً من ذلك، يمكن إجراء هذه الخطوة طوال الليل في درجة حرارة 4 °C وفي الظلام.

ملاحظة: قم أيضًا بتحضير عينة واحدة من الخلايا غير المصابة التي خضعت لإجراء صبغ "كليك" (click staining) ولكن لن يتم صبغها مناعيًا، حيث ستكون هذه العينات مطلوبة لمعايرة جهاز قياس التدفق الخلوي (flow cytometer). استخدم إما نصف الخلايا التي خضعت للعدوى الوهمية (mock infected) أو أضف بئرًا إضافيًا لخلايا غير مصابة في الخطوة 1.2.

ملاحظة: عند تكييف هذا البروتوكول للاستخدام مع فيروس مختلف، قم بتحديد التخفيف الأمثل للأجسام المضادة الأولية أولاً.

2. اغسل الخلايا مرتين باستخدام منظم FACS.
3. أعد تعليق الخلايا في 200 μl من الجسم المضاد الثانوي (anti-mouse IgG المقترن بصبغة فلورية [أقصى انبعاث/إثارة: 495/519 nm]) والمخفف في منظم FACS بنسبة (1:1,000)، ثم حضنها لمدة 1 hr في درجة حرارة الغرفة (RT) في الظلام.
4. اغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام منظم FACS.

ملاحظة: في هذه المرحلة، يمكن تخزين الخلايا طوال الليل في درجة حرارة 4 °C في الظلام.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
5-ethynyl-uridine	Berry Associates	PY 7563	يُذاب في DMSO لتحضير محلول مخزون بتركيز 100 mM
غطاءات شرائح دائرية 12-mm	Fisherbrand	12-545-82
أنابيب بوليسترين 5 ml	BD Biosciences	352058
Actinomycin D (ActD)	Sigma	9415	يُذاب في DMSO لتحضير محلول مخزون بتركيز 10 mM
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG	Invitrogen	A-11029
Bovine Serum Albumin (BSA)	Santa Cruz	sc-2323
CuSO₄	Sigma	C-8027	يُذاب في H2O لتحضير محلول مخزون بتركيز 100 mM
DAPI	Sigma	D-9542	يُذاب في H2O لتحضير محلول مخزون بتركيز 5 mg/ml
DMEM	Invitrogen	11965092
FBS	Invitrogen	16000044
أزيد فلوري (مقترن بـ Alexa Fluor 594)	Invitrogen	A10270
أزيد فلوري (مقترن بـ Alexa Fluor 657)	Invitrogen	A10277
Fluoromount-G	Southern Biotech	0100-01
L-ascorbic acid	Sigma	A-5960	يُذاب في H2O بتركيز 500 mM
مرشح ورقي	VWRbrand	28333-087
paraformaldehyde	Sigma	158127
Penicillin-Streptomycin	Invitrogen	15140122
poly-L-lysine (MW ≥ 70000)	Sigma	P1274
Triton X-100	Sigma	T-8787
Trizma base	Sigma	T-1503	يُذاب في H2O لتحضير محلول مخزون بتركيز 1.5 M، و pH 8.5
Trypsin-EDTA	Invitrogen	25200056
مجهر فلوري			مثل Olympus IX71
جهاز قياس التدفق الخلوي			مثل BD Biosciences LSRII Fortessa