إنتاج الجسيمات الفيروسية القهقرية لنقل الجينات

الملخص

إنتاج الفيروس القهقري قم بنشر معلق خلوي أحادي من خلايا Bosc23 (6 × 106) في طبق بتري بقطر 16 سم، وزرعها في 18 مل من وسط DMEM (وسط إيجل المعدل من دلبكو) المحتوي على 10% من FBS (مصل جنين البقر) حتى تصل درجة تلاقي المزرعة إلى 80% (خلال 24 ساعة). ملاحظة: يجب أن تنمو الخلايا في طبقة واحدة وألا تشكل تكتلات في المزرعة. يمكن إجراء عد الخلايا باستخدام طرق مختلفة (وهي صالحة لبقية البروتوكولات المعروضة هنا). في حالة وجود عدد قليل من العينات، يوصى بالعد اليدوي تحت المجهر باستخدام غرفة Bürker؛ وفي هذه الحالة، استخدم صبغة Trypan blue لاستبعاد الخلايا الميتة. اخلط الخلايا بنسبة 1:1 مع صبغة Trypan Blue بتركيز 0.4% في محلول PBS (محلول ملحي منظم بالفوسفات). ولإجراء عد لعدد كبير من العينات، يمكن استخدام عداد خلايا آلي. اجمع 40 ميكروغرام من البنية الفيروسية القهقرية (مثل MSCV)، و20 ميكروغرام من pCL-Eco (ناقل التعبئة)، و80 ميكرولتر من PEI (بولي إيثيلين إيمين)، و2 مل من وسط منخفض المصل (مثل Opti-MEM (الوسط الأساسي الأدنى)) بدون مضادات حيوية. قم بحضن هذا الخليط لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT). استبدل وسط خلايا Bosc23 بعناية بـ 16 مل من وسط DMEM المدعم بـ 2% من FBS. قم بتدفئة الوسط مسبقاً إلى 37 درجة مئوية قبل الاستخدام. ملاحظة: لا تستخدم المضادات الحيوية أثناء عملية عفن الخلايا (transfection)، لأنها قد تقلل من كفاءة العفن. أضف الخليط الذي تم تحضيره في الخطوة 1.2 تدريجياً وبحذر إلى مزرعة Bosc23، واحضنها لمدة 4 ساعات عند 37 درجة مئوية. اجعل فترة الحضن أقل من 6 ساعات بسبب سمية PEI. بعد الحضن، قم بتغيير وسط Bosc23 إلى 18 مل من وسط DMEM المدفأ مسبقاً والمحتوي على 10% من FBS، وازرع الخلايا لمدة 48 ساعة عند 37 درجة مئوية. ضع الأطباق في مختبر من المستوى الثاني للسلامة البيولوجية، واتبع إجراءات السلامة القياسية. اجمع وسط Bosc23 (الذي يحتوي على الجسيمات الفيروسية القهقرية ذات الخصائص البيئية) باستخدام ماصة سيرولوجية سعة 25 مل في أنبوب مخروطي سعة 50 مل، واحفظه عند 4 درجات مئوية. ملاحظة: (هام) يجب أن تصل كفاءة العفن إلى 90% لإنتاج فيروس ذو عيار عالٍ. أضف 18 مل من وسط DMEM المدفأ مسبقاً والمحتوي على 10% من FBS إلى خلايا Bosc23 وازرعها لمدة 24 ساعة. كرر الخطوة 1.6. ملاحظة: يمكن تجميع السوائل الطافية للفيروس القهقري من الخطوتين 1.6 و1.8 بمجرد وصولها إلى نفس درجة الحرارة (4 درجات مئوية) للحفاظ على سلامة الفيروس. لتجنب تلوث السوائل الطافية الفيروسية بخلايا Bosc23، قم بطرد الفيروس المجموع مركزياً عند 1500 × g لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. قم بتقسيم الفيروس إلى حصص، وجمده سريعاً باستخدام الثلج الجاف أو النيتروجين السائل، واحفظه عند -80 درجة مئوية. ومع ذلك، لاحظ أن الفيروس المحضر حديثاً يكون ذا جودة أعلى من حيث كفاءة العدوى مقارنة بالمخزونات المجمدة. ملاحظة: (هام) تجنب تكرار تجميد وإذابة الفيروس، لأن ذلك يؤدي إلى تحلل الفيروس. زيابلوفسكايا، ب.، وآخرونتكاثر وتمايز الخلايا السلفية النخاعية الفأرية 32D/G-CSF-R. مجلة التجارب المرئية (J. Vis. Exp.) (2018)

يوضح هذا الفيديو عملية إنتاج جزيئات فيروسية قهقرية مأشوبة عن طريق ترنسفكشن خلايا تغليف مشتقة من كلية بشرية، مما يسمح بنقل الجينات بشكل مستقر إلى الخلايا المستهدفة من أجل تطبيقات لاحقة مثل التعديل الجيني، أو المقايسات الوظيفية، أو دراسات تمايز السلالات.

البروتوكول

1. إنتاج الفيروس القهقري
   1. قم بنشر معلق خلوي أحادي من خلايا Bosc23 (6 × 10⁶) في أطباق بتري بقطر 16 cm وازرعها في 18 mL من وسط DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) الذي يحتوي على 10% FBS (مصل بقري جنيني) حتى تصل درجة تلاقي المزرعة إلى 80% (24 h).
      ملاحظة: يجب أن تنمو الخلايا في طبقة واحدة وألا تشكل تكتلات في المزرعة. يمكن إجراء عد الخلايا باستخدام طرق مختلفة (وهذا ينطبق على بقية البروتوكولات المعروضة هنا). في حال كان عدد العينات قليلاً، يوصى بالعد اليدوي تحت المجهر باستخدام غرفة Bürker. وفي هذه الحالة، استخدم صبغة Trypan blue لاستبعاد الخلايا الميتة. اخلط الخلايا بنسبة 1:1 مع 0.4% Trypan Blue في محلول PBS (محلول ملحي منظم بالفوسفات). ولإجراء العد لعدد كبير من العينات، يمكن استخدام جهاز عد الخلايا الأوتوماتيكي.
   2. اجمع 40 µg من البنية الفيروسية القهقرية (مثل MSCV)، و 20 µg من pCL-Eco (ناقل التغليف)، و 80 µl من PEI (polyethylenimine)، و 2 mL من وسط منخفض المصل (على سبيل المثال، Opti-MEM (Minimum Essential Medium)) بدون مضادات حيوية. احضن هذا الخليط لمدة 20 min في درجة حرارة الغرفة (RT).
   3. استبدل وسط خلايا Bosc23 بعناية بـ 16 mL من DMEM المدعم بـ 2% FBS. قم بتدفئة الوسط مسبقاً إلى 37 °C قبل الاستخدام.
      ملاحظة: لا تستخدم المضادات الحيوية أثناء عملية عفن الخلايا (transfection)، لأنها قد تقلل من كفاءة العملية.
   4. أضف الخليط الذي تم تحضيره في الخطوة 1.2 قطرة تلو الأخرى وبعناية إلى مزرعة Bosc23، واحضنها لمدة 4 h عند 37 °C. يجب ألا تزيد فترة الحضن عن 6 h بسبب سمية PEI.
   5. بعد الحضن، استبدل وسط Bosc23 بـ 18 mL من DMEM المدفأ مسبقاً والذي يحتوي على 10% FBS، وازرع الخلايا لمدة 48 h عند 37 °C. ضع الأطباق في مختبر من المستوى الثاني للسلامة البيولوجية (biosafety level 2)، واتبع إجراءات السلامة القياسية.
   6. اجمع وسط Bosc23 (الذي يحتوي على جزيئات الفيروس القهقري الإيكوتروبية) باستخدام ماصة سيرولوجية سعة 25-mL في أنبوب مخروطي سعة 50-mL، واحفظه عند 4 °C.
      ملاحظة: (هام) يجب أن تصل كفاءة عفن الخلايا إلى 90% لإنتاج فيروس عالي العيار (high-titer).
   7. أضف 18 mL من DMEM المدفأ مسبقاً مع 10% FBS إلى خلايا Bosc23 وازرعها لمدة 24 h.
   8. كرر الخطوة 1.6.
      ملاحظة: يمكن تجميع السوائل الطافية للفيروس القهقري من الخطوتين 1.6 و 1.8 بمجرد وصولها إلى نفس درجة الحرارة (4 °C) للحفاظ على سلامة الفيروس.
   9. لتجنب تلوث السوائل الطافية الفيروسية بخلايا Bosc23، قم بطرد الفيروس المجموع مركزياً عند 1500 × g لمدة 10 min عند 4 °C. قسم الفيروس إلى أجزاء (aliquot)، وقم بتجميده سريعاً باستخدام الثلج الجاف أو النيتروجين السائل، واحفظه عند -80 °C. ومع ذلك، يرجى ملاحظة أن الفيروس المحضر حديثاً يكون ذا جودة أعلى من حيث كفاءة العدوى مقارنة بالمخزونات المجمدة.
      ملاحظة: (هام) تجنب تكرار عمليات التجميد والإذابة للفيروس، لأن ذلك يؤدي إلى تحلله.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	15028
Opti-MEM ((Minimum Essential Medium) - وسط منخفض المصل	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	31985-047	L-Glutamine، Phenol Red
مصل جنين البقر (FBS)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	10270	يُستخدم لاستزراع خلايا HEK293T وNIH3T3 وBOSC23
بنسلين	Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)	P3032
ستربتوميسين	Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)	S9137	مسحوق ملح كبريتات الستربتوميسين
جنتاميسين	Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)	G1914
بولي إيثيلين إيمين	Polyscience, Warrington, PA, USA	23966	خطي، MW 25,000 (PEI 25000)