إنتاج فيروس المخلوي الرئوي المأشوب والموسوم ببروتين GFP باستخدام نظام تعبير T7

الملخص

استعادة الممر الأول للفيروس المؤتلف ملاحظة: يجب تنفيذ جميع الخطوات التالية في بيئة معقمة، باستخدام كابينة سلامة من الفئة الثانية (class II safety cabinet). في اليوم السابق لعملية عفن الخلية (transfection)، يتم تحضير معلق من خط الخلايا BSRT7/5 بتركيز 5 × 10^5 خلية/مل في وسط غذائي كامل. يتم توزيع 2 مل من معلق الخلايا في كل بئر من أطباق ذات 6 آبار. يُخصص بئر واحد لكل فيروس سيتم استعادته، وبئر إضافي كعنصر تحكم سلبي. تُحضن الأطباق عند 37 درجة مئوية و5% من ثاني أكسيد الكربون (CO2). يتم التأكد في اليوم التالي من وصول الخلايا إلى درجة تلاقي (confluence) تتراوح بين 80% و90%. يتم تذويب نواقل الفيروس المخلوي التنفسي (RSV) للوراثة العكسية p-RSV-GFP وp-RSV-M2-1-GFP، بالإضافة إلى p-N وp-P وp-L وp-M2-1. لكل فيروس يراد استعادته، يتم خلط 1 ميكروجرام من p-N وp-P، و0.5 ميكروجرام من p-L، و0.25 ميكروجرام من p-M2-1، و1.25 ميكروجرام من p-RSV (سواء GFP أو M2-1 GFP) في أنبوب. ملاحظة: يمكن استخدام نواقل تعبير مختلفة للبروتينات الفيروسية الخاصة بمعقد البوليميراز (N وP وL وM2-1)؛ ومع ذلك، يجب الحفاظ على النسبة بين هذه البروتينات. يتم إجراء التحكم السلبي باستبدال ناقل p-RSV بناقل فارغ. البدء في عملية عفن الخلية (راجع جدول المواد). أضف 250 ميكرولتر من وسط منخفض المصل إلى خليط النواقل. وفي أنبوب آخر، يتم تخفيف 10 ميكرولتر من كاشف عفن الخلية في 250 ميكرولتر من وسط منخفض المصل. يتم رج الأنبوبين بلطف باستخدام جهاز رج vortex والانتظار لمدة 5 دقائق. ثم تخلط محتويات الأنبوبين ويترك الخليط لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تُشطف خلايا BSRT7/5 بـ 1 مل من وسط منخفض المصل، ويوزع 1.5 مل من الوسط الأساسي الأدنى (MEM) المحتوي على 10% من مصل العجل الجنيني (FCS) والخالي من المضادات الحيوية في كل بئر. إذا لزم الأمر، تُحضن الخلايا عند 37 درجة مئوية و5% من ثاني أكسيد الكربون حتى تكتمل فترة الحضن الموضحة في الخطوة 1.3.1. عند انتهاء فترة الحضن التي استمرت 20 دقيقة، أضف 500 ميكرولتر من خليط عفن الخلية الذي تم تحضيره في الخطوة 1.3.1 إلى البئر. تُوضع الخلايا في الحاضنة عند 37 درجة مئوية و5% من ثاني أكسيد الكربون لمدة 3 أيام، مع مراعاة عدم تغيير الوسط الغذائي للخلايا أثناء عملية عفن الخلية. يتم رصد فلورة البروتين الفلوري الأخضر (GFP) (إثارة عند 488 نانومتر وانبعاث عند 515-535 نانومتر) تحت مجهر فلوري مقلوب بتكبير 20x مرة واحدة يومياً لمراقبة كفاءة الاستعادة، باستخدام مرشح GFP. بويييه، سي. وآخرون.استخلاص وتضخيم وتعيين عيار الفيروسات المخلخلة المأشوبة للفيروس المخلوي التنفسي. مجلة التجارب المرئية (J. Vis. Exp.) (2019)

يوضح هذا الفيديو كيفية توليد فيروس مخلوي تنفسي (RSV) مؤتلف يعبر عن البروتين الفلوري الأخضر (GFP) باستخدام نظام وراثة عكسية قائم على T7. يؤدي التعداء المشترك للبلازميدات التي تشفر البروتينات الفيروسية والجينوم المسمى بـ GFP إلى التعبير البروتيني وبدء عملية استعادة الفيروس.

البروتوكول

1. استعادة الممر الأول للفيروس مأشوب الجينات

ملاحظة: يجب تنفيذ جميع الخطوات التالية في بيئة معقمة، باستخدام كابينة سلامة من الفئة الثانية.

1. في اليوم السابق لعملية التعداء، يتم تحضير معلق من الخط الخلوي BSRT7/5 بتركيز 5 x 10⁵ cells/mL في وسط غذائي كامل. يتم توزيع 2 mL من معلق الخلايا في كل بئر من طبق يحتوي على 6 آبار. يتم تجهيز بئر واحد لكل فيروس سيتم استعادته، وبئر إضافي كعينة ضابطة سالبة. تُحضن الصفيحة عند 37 °C و5% CO₂، ويتم التأكد من وصول الخلايا إلى درجة تلاقي تتراوح بين 80%–90% في اليوم التالي.
2. يتم إذابة ناقلات الفيروس المخلوي التنفسي (RSV) الخاصة بالوراثة العكسية p-RSV-GFP وp-RSV-M2-1-GFP، بالإضافة إلى p-N وp-P وp-L وp-M2-1. يتم خلط 1 µg من كل من p-N وp-P، و0.5 µg من p-L، و0.25 µg من p-M2-1، و1.25 µg من p-RSV (سواء GFP أو M2-1 GFP) في أنبوب لكل فيروس سيتم استعادته.
   ملاحظة: يمكن استخدام ناقلات تعبير مختلفة للبروتينات الفيروسية الخاصة بمعقد البوليميراز (N وP وL وM2-1)؛ ومع ذلك، يجب الحفاظ على النسبة بين هذه البروتينات. يتم إجراء العينة الضابطة السالبة باستبدال ناقل p-RSV بناقل فارغ.
3. المباشرة في عملية التعداء (انظر جدول المواد).
   1. يُضاف 250 µL من وسط غذائي منخفض المصل إلى الناقلات المختلطة. وفي أنبوب آخر، يتم تخفيف 10 µL من كاشف التعداء في 250 µL من وسط غذائي منخفض المصل. يتم رج كلا الأنبوبين بلطف باستخدام جهاز الـ vortex والانتظار لمدة 5 min. ثم تخلط محتويات كلا الأنبوبين وتترك لمدة 20 min في درجة حرارة الغرفة.
   2. تُشطف خلايا BSRT7/5 باستخدام 1 mL من وسط غذائي منخفض المصل، ويوزع 1.5 mL من الوسط الأساسي الأدنى (MEM) مع 10% من مصل العجل الجنيني (FCS) بدون مضادات حيوية في كل بئر. وإذا لزم الأمر، يتم التحضين عند 37 °C و5% CO₂ حتى تكتمل فترة التحضين الموضحة في الخطوة 1.3.1.
   3. يُضاف 500 µL من خليط التعداء الذي تم تحضيره في الخطوة 1.3.1 إلى البئر عند انتهاء فترة التحضين التي استغرقت 20 min. توضع الخلايا في الحاضنة عند 37 °C و5% CO₂ لمدة 3 days، مع مراعاة عدم تغيير وسط زراعة الخلايا أثناء عملية التعداء.
4. يتم رصد تألق البروتين الفلوري الأخضر (GFP) (إثارة عند 488 nm وانبعاث عند 515–535 nm) باستخدام مجهر فلوري مقلوب بتكبير 20x مرة واحدة يومياً لمراقبة كفاءة الاستعادة، وذلك باستخدام مرشح GFP.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
BSRT7/5		غير متوفر تجارياً	راجع المرجع 22. Buchholz et al. 1999
مجهر فلوري للملاحظات	Olympus	IX73 Olympus microscope
مجهر فلوري للتصوير المجهري بالفيديو	Olympus	ScanR Olympus microscope
HEp-2	ATCC	ATCC CCL-23
HEPES ≥99.5%	Sigma	H3375
L-Glutamine (200 mM)	ThermoFisher Scientific	25030024
كاشف Lipofactamine 2000	ThermoFisher Scientific	11668019	تم تحسين البروتوكول في الخطوة 2.3. لهذا الكاشف.
MEM (10x)، بدون جلوتامين	ThermoFisher Scientific	11430030
MEM، مكمل GlutaMAX	ThermoFisher Scientific	41090-028
MgSO4 ReagentPlus، ≥99.5%	Sigma	M7506
وسط Opti-MEM I منخفض المصل	ThermoFisher Scientific	51985-026
بلازميدات		غير متوفر تجارياً	راجع المرجع 21. Rameix-Welti et al. 2014