اختبار معايرة اللويحات لقياس كمية الفيروس المخلوي الجدري المعدي

الملخص

المصدر: Bouillier, C., et al. توليد وتضخيم وتعيير فيروسات الجهاز التنفسي المخلوي المعدلة وراثياً. J. Vis. Exp. (2019)

يوضح الفيديو مقايسة معايرة اللويحات المستخدمة لتقدير كمية الفيروس المخلوي التنفسي (RSV) المؤتلف المعدي في طبقات أحادية من الخلايا الطلائية. كما يستعرض عملية إصابة الخلايا المضيفة بمعلقات فيروسية مخففة تسلسلياً، وتقييد انتشار الفيروس بواسطة طبقة تغطية شبه صلبة قائمة على السليلوز، وتكوين لويحات موضعية نتيجة للتأثيرات المرضية الخلوية. وتنتهي الإجراءات بالصبغ، وإزالة التلوث، وعد اللويحات لتحديد العيار الفيروسي وتقييم قدرة RSV على العدوى.

البروتوكول

1. مقايسة معايرة اللويحات

1. قم بتجهيز أطباق ذات 12 بئراً لإجراء عملية التعيير في اليوم السابق لإجراء مقايسة التعيير (سيتطلب تعيير أنبوب واحد من الفيروس ستة آبار). ازرع في الآبار 1 مل من خلايا ظهارية بشرية من النوع الثاني (HEp-2) بكثافة 5 × 10⁵ خلية/مل في وسط غذائي كامل.
2. في اليوم التالي، قم بتحضير معلق سليلوز دقيق البلورات معقم (بتركيز 2.4% [وزن/حجم] في الماء) (راجع جدول المواد).
   1. قم بتشتيت 2.4 جم من مسحوق السليلوز الجريئي (microcrystalline cellulose) في 100 مل من الماء المقطر، باستخدام محرك مغناطيسي قياسي، حتى يذوب المسحوق تماماً (عادةً ما يستغرق ذلك من 4 إلى 12 ساعة). ثم قم بمعالجة المعلق بجهاز التعقيم البخاري (autoclave) عند 121 °C لمدة 20 دقيقة، ويُحفظ في درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام.
      ملاحظة: تظل المعلق مستقراً لمدة سنة واحدة في ظل هذه الظروف.
   2. بعد فتح المحلول في بيئة معقمة، يُحفظ في درجة حرارة 4 °C لمدة 6 أشهر. يجب دائمًا خلط المعلق قبل الاستخدام (عن طريق الرج اليدوي أو استخدام جهاز المزج الدوامي vortex) لضمان تجانسه.
3. قم بتحضير الـ 2× وسط مزارع الخلايا الأساسي الأدنى (MEM) في بيئة معقمة. خفف وسط MEM التجاري بمقدار 10× بماء معقم، ثم أضف L-glutamine، و1,000 وحدة/مل من البنسلين، و1 ملغ/مل من الستربتومايسين. رُجّ المخفف بقوة واحفظه في 4 °C.
   ملاحظة: نفذ الخطوات من 1.4 إلى 1.10 في بيئة معقمة باستخدام كبينة سلامة من الفئة الثانية.
4. قم بتحضير ستة أنابيب تحتوي على 900 µL من وسط MEM الخالي من مصل العجل الجنيني (FCS) لكل فيروس سيتم تعييره (أنابيب التعيير). أذب حصص الفيروس المجمدة، وقم برجها بقوة باستخدام جهاز vortex لمدة 5 ثوانٍ، ثم انقل 100 µL إلى أنبوب المعايرة الأول.
5. قم بإجراء تخفيف بمقدار عشرة أضعاف 6×، على النحو التالي. أضف 100 μL من الفيروس إلى 900 μL من الوسط في الأنبوب الأول، ثم أغلق الأنبوب بالغطاء، وامزج محتوياته باستخدام جهاز الرج الميكانيكي (vortexing) لبضع ثوانٍ. استبدل رأس الماصة، ثم أضف 100 µL من التخفيف الأول إلى 900 µL من الوسط في الأنبوب الثاني، ثم أغلق الأنبوب بالغطاء، وقم بالخلط باستخدام جهاز الفورتكس (vortex). كرر هذه العملية حتى الأنبوب السادس.
   ملاحظة: من المهم جداً تغيير رأس الماصة عند كل تخفيف.
6. اكتب اسم الفيروس ومعاملات التخفيف على أطباق HEp-2 ذات الـ 12 بئراً. ضع علامة لربط كل طبق بغطائه، فقد ينفصلان أثناء عملية التلوين (الخطوة 1.9). قم بإزالة الوسط من الأطباق ثم وزع 400 µL من تخفيف واحد في كل بئر. تُحضن الأطباق عند 37 °C لمدة ساعتين، لامتصاص الفيروس.
   ملاحظة: قم بتغيير طرف الماصة بين كل لقاح وآخر، أو انتقل من التركيز الأدنى إلى الأعلى باستخدام نفس الطرف. قم بتلقيح مجموعة محدودة من الأطباق (1 إلى 2) في وقت واحد لتجنب جفاف الخلايا.
7. قم بتحضير طبقة التغطية من السليلوز دقيق التبلور أثناء فترة امتصاص الفيروس (تحضير فوري). وللحصول على 100 مل من طبقة التغطية، اخلط 10 مل من معلق السليلوز دقيق التبلور بتركيز 2.4%، مع 10 مل من 2× وسط MEM، و80 مل من وسط MEM مع 2% من مصل جنين العجل (FCS).
   1. اضبط الرقم الهيدروجيني لـ 2× ضبط الرقم الهيدروجيني لوسط MEM ليكون حوالي 7.2 باستخدام محلول بيكربونات الصوديوم المعقم بتركيز 7.5%، وذلك بالاستعانة بمؤشر اللون. ثم أضف معلق السليلوز دقيق التبلور ووسط MEM وامزجهما بقوة.
8. في نهاية فترة الحضن التي تستمر لمدة ساعتين، أضف من 2 إلى 3 مل من الطبقة الفوقية (overlay) إلى كل بئر من آبار الأطباق ذات الـ 12 بئرًا دون إزالة اللقاح. توخَّ الحذر لتجنب تلوث الآبار المجاورة باللقاحات ذات العيار الفيروسي المرتفع. يتم حضن الطبق عند 37 °C و5% من ثاني أكسيد الكربون (CO2)₂ لمدة 6 أيام. يجب عدم تحريك الطبق أو الحاضنة أثناء فترة الحضن.
9. باشر بصبغ الخلايا باستخدام محلول البنفسج البلوري (8% بنفسج بلوري [حجم/حجم]، و2% فورمالدهيد [حجم/حجم]، و20% إيثانول [حجم/حجم] في الماء).
   1. قم بحماية سطح العمل في كابينة السلامة الحيوية بوضع ورقة تغطية (حيث إن صبغة البنفسج البلوري تسبب تلون الأسطح بقوة).
   2. رُجّ الأطباق برفق لإزالة طبقة السليلوز ميكروكريستاليين (microcrystalline cellulose) العلوية. تخلص من السوائل الطافية واغسل الخلايا مرتين.× مع 1× محلول ملحي منظم بالفوسفات (PBS). تعامل مع الأطباق واحداً تلو الآخر لتجنب جفاف الخلايا. أضف 1-2 مل من محلول البنفسج البلوري (crystal violet) وانتظر لمدة 10-15 دقيقة. قم بإزالة المحلول، والذي يمكن إعادة استخدامه لصبغ الأطباق اللاحقة.
   3. اغمر الأطباق والأغطية في محلول مبيّض حديث لتحضيره لبضع ثوانٍ، ثم اغسلها جيداً بماء الصنبور. لاحظ أنه يتم تطهير الأطباق والأغطية بواسطة المبيّض.
   4. ضع الأطباق وأغطيتها على مناشف ورقية واتركها لتجف. جفف الأطباق في درجة الحرارة المحيطة بعد شطفها بالماء، ثم خزّنها في درجة حرارة الغرفة. ولأغراض التخزين لفترات طويلة (عدة أشهر)، تُحفظ الأطباق بعيداً عن الضوء للحفاظ على اللون. علماً أنه في حال فقد الخلايا للونها، يمكن صبغها مرة أخرى باستخدام البنفسج البلوري (crystal violet).
10. احسب عيارات الفيروس. قم بعدها البقع (plaques) في آبار الأطباق الجافة، والتي تكون مرئية بالعين المجردة. تأكد من أن عدد البقع في التخفيفات المختلفة متسق (بمعامل 10 بين كل تخفيف). اختر البئر التي يسهل فيها عد البقع. قدر عدد البقع مقابل حجم اللقاح والتخفيف.
    ملاحظة: بناءً على المثال المقدم في الشكل 1، وتم عد 21 لوحة عند التخفيف 10^-5 تخفيف. وتتوافق هذه القيم مع عيار يبلغ

النتائج

الشكل 1: تقدير عيار RSV باستخدام مقايسة اللويحات. (أ) نتائج مقايسة معايرة اللويحات في طبق مكون من 12 بئراً. تظهر الآبار الستة المصابة بتخفيفات تسلسلية من مخزون فيروسي واحد. يشار إلى التخفيفات وفق مقياس لوغاريتم الأساس 10. تظهر جميع الخلايا المصابة بالتخفيفات الثلاثة الأولى منفصلة. وتعتبر أعداد اللويحات الملاحظة مع التخفيفات 10^-4 و10^-5 و10^-6 متسقة. (ب) توضيح لعد اللويحات (الأرقام الصفراء). وتشير النجمة الخضراء إلى وجود خدوش في طبقة الخلايا.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
محلول البنفسج البلوري (Crystal violet)	Sigma	HT90132
HEp-2	ATCC	ATCC CCL-23
وسط MEM (10x)، بدون جلوتامين	ThermoFisher Scientific	11430030
وسط MEM، مكمل GlutaMAX	ThermoFisher Scientific	41090-028
محلول بيكربونات الصوديوم 7.5%	ThermoFisher Scientific	25080094
بنسلين-ستريبتومايسين (10,000 U/mL)	ThermoFisher Scientific	15140122